Lentivirus הפקה

הליך זה מתחיל בהעברה (transfection) של תאי 2 9 3 T עם לנטי-וירוס, פלסמיד ווקטורים לאריזה ויראלית, כאשר התסנין הוויראלי נאסף לאחר תקופת דגירה של 48 שעות לפחות. התסנין מסונן כדי להיות מרוכז באמצעות אולטרה-צנטריפוגה לאחר ביצוע אולטרה-צנטריפוגציה. המשקע הוויראלי מומס מחדש ב-PBS כדי לקבוע את התר, ראשית מדוללים את הוירוס המרוכז במצע גידול מלא, ולאחר מכן מבצעים דילול סדרתי כדי להדביק את התאים בלנטי-וירוס.

שלום, אני שיין וונג מהמעבדה של מייקל מקמאנוס במרכז לסוכרת באוניברסיטת קליפורניה בסן פרנסיסקו. אני מייקל מקמאנוס. היום נדגים לכם פרוטוקול להפקה של לנטי-וירוסים.

אנו משתמשים בהליך זה במעבדה כדי להכין לנטי-וירוסים עבור השתקה (RNA interference). אז בואו נתחיל. כדי להתחיל בפרוטוקול זה, הכינו את ה-DNA שבו תבצעו טרנספקציה לתאי 2 9 3 T.

ראשית, דללו את ריאגנט הטרנספקציה FU gene six במבחנה של 1.5 מיליליטר על ידי ערבוב של 30 µL של Fuji six עם 600 µL של מצע ללא סרום. הקפידו ש-Fuji לא ייגע בדפנות המבחנה בעת הוספתו למצע, והדגרירו בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. לאחר מכן, במכסה של המבחנה, ערבבו 4 µg של פלסמיד לנטי-ויראלי עם 1.33 µg.

כל אחד מוטורי אריזה ויראליים מהדור השלישי. הפלסמיד הלנטי-ויראלי מכיל את ה-DNA. הווירוס יטמע בתוך הגנום של כל תא שיודבק, בעוד שמוטורי האריזה מכילים גנים לכל שאר החלבונים הדרושים ליצירת וירוס לנטי. סגור את המכסה וערבב על ידי הפיכת המבחנה מספר פעמים.

דגרו את ה-DNA ואת ריאגנט הטרנספקציה במשך 15 עד 20 דקות בטמפרטורת החדר. כעת הגיע הזמן לבצע טרנספקציה לתאי 293 עם ה-DNA שהכנתם; השתמשו בתאים שזרעתם 24 שעות מראש והגיעו ל-50% עד 70% קוֹנפְלוּאֶנְסִי (confluency) בתוך מנף התרבית. העבירו בעזרת פיפטה את כל ה-DNA שהוכן אל צלחת תאי ה-293, ערבבו בעדינות על ידי הטיית הצלחת קדימה ואחורה, והחזירו את התאים לאינקובטור כדי לאפשר להפקת הנגיפים להימשך במשך 48 עד 96 שעות לפני הקציר. במהלך הדגירה, תאי ה-293 מייצרים לנטיוירוסים שגנומיהם מכילים עותק RNA של ה-DNA הרצוי.

עתה הגיע הזמן לאסוף את הווירוס. הוצא את התאים מהאינקובטור. הכן במנדף לתרביות רקמה מסנן מזרק של 0.4 או חמישה מיקרון, מזרק חד-פעמי של 10 מיליליטר ושפופרת צנטריפוגה מסוג UltraClear של Beckman.

השתמש במזרק חד-פעמי כדי להסיר את הנוזל העליון (supernatant), המכיל כעת את הנגיף. חבר מסנן מזרק של 0.45 מיקרון לקצה המזרק וסנן את הנגיף אל תוך מבחנת צנטריפוגה מסוג UltraClear Beckman. המסנן מאפשר רק לנגיפים, ולא לתאים, לעבור דרכו; לאחר מכן השלך את התאים המייצרים נגיפים שנותרו באינקובציה.

השרו פלטות תרבית, מזרקים ומסננים בתמיסת אקונומיקה 10% למשך 45 דקות. כעת, לאחר שאספתם וסיננתם את הווירוס, הגיע הזמן לרכז תחילה את הווירוס באמצעות אולטרה-צנטריפוגה. השתמשו ב-DMEM נטול סרום כדי לאזן את כל המבחנות המכילות וירוס כך שההפרש ביניהן לא יעלה על 0.2 גרם.

בשלב הבא, העמיסו את מבחנות הצנטריפוגה המאוזנות לתוך דליי הרוטור מסוג SW 41 TI או SW 28. אטמו את דליי הרוטור והשחילו אותם אל הרוטור. לאחר מכן, הניחו את הרוטור בתוך האולטרה-צנטריפוגה.

סובב את הווירוס במשך כ-90 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס במהירות של 25,000 RPM ברוטור SW 41 TI, או במהירות של 24,000 RPM ברוטור SW 28. לאחר הצנטריפוגציה, חזור למנדף של תרבית הרקמה והפוך את המבחנה כדי לשפוך את ה-SNAT לתוך מכל המכיל 10% bleach. השתמש בנייר Kim wipe כדי לספוג נוזלים עודפים מסביב למשקע והפוך את המבחנה על גבי מעמד נוח למשך לא יותר מחמש דקות, עד שתהיה מוכן לביצוע רספנסיה של המשקע.

כדי להמיס מחדש את משקע הנגיף, השתמשו בטיפ עם פילטר כדי להוסיף 100 µl של PBS סטרילי שעבר סינון מוקדם לשפופרת. לאחר מכן, בצעו פיפטינג (שאיבה ופליטה) כ-20 פעמים. השאירו את הנגיף בטמפרטורה של 4°C למשך הלילה כדי להשלים את ההמסה.

ניתן לאחסן תכשירים נגיפיים בטמפרטורה של ארבע מעלות למשך כשבוע ובטמפרטורה של מינוס 80 מעלות למשך עד שנה אחת. זכרו לטפל בכל השפופרות הריקות ב-10% bleach לפני השלכתן. אם בכוונתכם להשתמש בתכשיר הנגיפי למשך יותר משבוע, הוא יישמר במקרר.

הכינו אליקוטות מינימליות של 5 עד 20 µL עבור ניסויים עתידיים ואליקוטה אחת של 3 עד 5 µL עבור קביעת הטיטר (titration), הקפיאו ואחסנו את האליקוטות בטמפרטורה של כ-80- °C. השלב הבא הוא קביעת הטיטר הוויראלי. אם כללתם גן רפורטר פלואורסצנטי בפלסמיד הלנטי-וויראלי, התאים המודבקים יפגינו פלואורסצנציה וניתן יהיה לקבוע את הטיטר הוויראלי באמצעות ציטומטריית זרימה.

בתחילה, דללו שלושה µL של נגיף רכז לתוך 1.5 mL של מצע מלא בבארות אחת עד שש, בשורה אחת של פלטת 96 בארות. בצעו את הדילולות הסדרתיות הבאות לכל שש הבארות ב-100 µL של DM מלא. לבאר הראשונה הוסיפו 100 µL של מצע ללא נגיף.

זוהי ביקרת האי-צביעה שלך. לבאר השנייה נוסיף 100 µL מהנגיף המדולל. לבאר השלישית נוסיף 100 µL מהתערובת של הבאר השנייה אל הבאר הרביעית.

נוסיף 100 µL מהבאר השלישית לבאר החמישית. נוסיף 100 µL מהבאר הרביעית לבאר השישית. נוסיף 100 µL מהבאר החמישית.

לבסוף, הוציאו 100 µL מהבאר השישית והשליכו אותם למיכל עם אקונומיקה. השלימו את הנפח הכולל בכל הבארים ל-200 µL באמצעות DMEM. בכל דילול, ריכוז הנגיף פוחת בחצי. שימו לב כי אלו הם דילולים מוצעים בלבד, שאמורים להתאים לטיטרציה של רוב הנגיפים בריכוז גבוה.

אם התרכזות הנגיף (titer) נמוכה או אם הנגיף אינו מרוכז, ייתכן שיהיה עליך להתאים את הדילול. יש לטפל בכל נגיף מדולל שלא נעשה בו שימוש ב-10% bleach למשך 45 דקות לפני השליכה למכל פסולת ביולוגית מסוכנת. הוסף כ-15,000 תאי 2 9 3 T בריאים המתחלקים באופן פעיל לכל אחת משש הבארות.

ניתן להשתמש בפלטה אחת של 96 בארות כדי לתתר 16 דגימות נגיפיות, להשלים את נפח הבארות ל-200 microliters, להחזיר את התאים לאינקובטור ולאפשר לזיהום להימשך לפחות 48 שעות. לאחר האינקובציה, נתחו את פלואורסצנציית התאים באמצעות ציטומטר זרימה. ניתן להשתמש באחוז התאים הפלואורסצנטיים לכל באר כדי לקבוע את התיתר או את מספר החלקיקים הנגיפיים המדבקים למיליליטר של נגיף שהוסף.

חשב את מספר היחידות הזיהומיות למילליליטר באמצעות הנוסחה הבאה בעת פירוש תוצאות ה-flow cytometer. שים לב שניתן להשיג חישובים מדויקים של הטיטר רק כאשר תאים מזוהמים קיבלו לא יותר מאינטגרציה ויראלית אחת לתא.

כדי להבטיח שזהו אכן המצב, השתמשו בחישובים בתאים עם שיעור הדבקה של פחות מ-15%. תאים עם שיעורי הדבקה גבוהים יותר קיבלו ככל הנראה מספר רב של אינטגרציות ויראליות לתא. הדילול המוצע בשלב השני אמור להניב מספר דגימות בטווח הדבקה זה.

מומלץ להשתמש במספר דגימות כדי ליצור גרף טיטרציה שממנו ניתן לחשב את הטיטר הסופי. ניתן להשתמש בנוסחה המחושבת מהקו הליניארי המותאם כדי לחשב את הטיטר הוויראלי, אך ניתן לחשב את הטיטר באמצעות דגימה אחת במידת הצורך. ניתן לצפות לטיטר של 1x10⁷ יחידות התהייה (transducing units) למילליליטר עבור נגיף שאינו מרוכז, ו-1x10⁸ יחידות התהייה למילליליטר עבור נגיף מרוכז.

הרגע הצגנו בפניכם כיצד לייצר לנטי-וירוסים במהלך ביצוע פרוצדורה זו. חשוב להקפיד על כל תקנות הבטיחות הביולוגית ולפנות את הפסולת כראוי. זהו כל התהליך.

תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.