אריזות ל-HIV או FIV מבוססי בונה הביטוי Lentivector שימוש התמרה של VSV-G חלקיקים נגיפיים Pseudotyped

המטרה הכללית של הליך זה היא ללמוד על אריזה של לנטיווירוס (lentiviral packaging). פרוטוקול של חמישה ימים. ביום הראשון, תאי 2 9 3, TN producer נזרעים בצפיפות מחושבת.

ביום השני, מבצעים טרנספקציה לתאים עם מבנה וקטור ה-lenti הנבחר המכיל את הגן המבוקש ותערובת פלסמידי אריזה ויראליים. ביום הרביעי, קוצרים את ה-viral sate ומרכזים אותו על ידי הוספת תמיסה להשקעת נגיפים באמצעות PEG. השלבים הסופיים של הפרוטוקול הם קציר הנגיפים המרוכזים ב-PEG, חלוקת הנגיפים למנות (aliquots) והדבקת תאים בנגיפים המרוכזים לצורך קביעת הטיטר הוויראלי.

בסופו של דבר, qPCR של גנים שהשתלבו באופן יציב משמש לחישוב מספר המבנים שהשתלבו באופן יציב. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון טרנספקציה של פלסמיד או טרנסדוקציה רטרו-ויראלית, הוא שפרוטוקול אריזת הלנטי-ויראלי המותאם של FBI מייצר נגיף פעיל פונקציונלית בתר גבוה, המאפשר העברה יעילה כמעט לכל תא של יונקים, כולל תאים שקשה לבצע בהם טרנספקציה, כגון תאי גזע ותאי מקור שאינם מתחלקים. באופן כללי, אנשים שאינם מכירים את השיטה יתקלו בקושי בשל חוסר היכרות עם פרטי הפרוטוקול הקטנים, החיוניים לייצור מוצלח של נגיף בתר גבוה.

הדגמה חזותית של שיטה זו היא מועילה, שכן צפיפות התאים הנצפית במיקרוסקופ במהלך הטרנספקציה קובעת את יעילות האריזה הוויראלית, אשר קובעת את הטיטר הוויראלי הסופי. במקרים הרלוונטיים, ביטוי של רפורטר פלואורסצנטי קובע את יעילות הטרנספקציה, דבר המשפיע באופן משמעותי על הטיטר הוויראלי הסופי. בנוסף, הדגמה חזותית של שיטה זו מסייעת לחוקרים להכיר חלקים עדינים אך חשובים בפרוטוקול, כגון שיטות עבודה מומלצות לשמירה על סטריליות לאורך התהליך כולו, וכיצד למנוע הכללת שיירי תאים בנגיף המוקצץ.

אריזה לנטיוויראלית יעילה מסתמכת על שלושה רכיבים. ראשית, וקטור הביטוי הלנטיוויראלי חייב להכיל חלק מהאלמנטים הדרושים לאריזת הנגיף ולהשתלבות יציבה, כמו גם אלמנטים לביטוי הגן המבוקש. סיבוב שיער קצר (Short hairpin), RNA, micro RNA או קסטת דיווח (reporter cassette).

שנית, פלסמידי האריזה הלנטיביריים חייבים לספק את החלבונים החיוניים לאריזה של עותק RNA של מבנה הביטוי לתוך חלקיקים פסיידו-ויראליים רקומביננטיים, ולתמלול הפוך (reverse transcription) ושילוב של הנגיף בעקבות ההדבקה. שלישית, יש להעביר טרנספקציה זמנית משותפת של וקטורי הביטוי והאריזה לתאי יצרן מסוג 2 9 3 TN. תאים אלו מייצרים טיטרים גבוהים של חלקיקים פסיידו-ויראליים שיש לאסוף מתוך מצע התרבית.

בסופו של דבר, הצלחת הטרנסדוקציה של תאי המטרה תלויה בעיקר במספר החלקיקים הוויראליים לכל תא עבור סוג תא נתון. במילים אחרות, ריבוי הזיהום (multiplicity of infection). התחל בגידול של תאי 2 9 3 TN בצלחות תרבית תאים של 15 סנטימטר למשך 18 עד 24 שעות כדי להגיע ל-60% עד 80% קונפלואנס.

במועד התעתוק (transfection), כל מנת תאים בצלחת תשגיח כ-14 מיליון תאים על מנת להגדיל את תנובת הווירוס. ניתן להשתמש ביותר מצלחת אחת למחרת, כאשר תאי 2 9 3 TN מגיעים ל-60% עד 80% התמזגות (confluence), הם מוכנים לתעתוק. עבור כל צלחת תאים, העבירו 1.6 milliliters של DMEM ללא סרום למבחנה מסוג falcon בנפח 15 milliliter.

לאחר מכן, הוסיפו 22.5 µg של ppac H one או Ppac F1 ו-4.5 µg של קונסטרוקט הוקטור הלנטי שלכם ל-DMEM וערבבו על ידי פיפטינג למעלה ולמטה. לאחר מכן, הוסיפו 55 µL של pure affection לאותה מבחנה וערבבו ב-vortex למשך 10 שניות, ולאחר מכן דגרו למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר 15 דקות, הוסיפו מבחנה אחת לכל צלחת תרבית.

טפטפו את התמיסה ולאחר מכן סובבו בעדינות את הפלטה, ואז דגרו את התאים למשך 48 שעות בטמפרטורה של 37 °C עם 5% carbon dioxide. לאחר 48 שעות, אם מבנה וקטור הלנטי מבטא גן פלורסצנטי כגון GFP, בדקו את התאים תחת מיקרוסקופ; טרנספקציה מוצלחת תניב בין 50% ליותר מ-90% תאים פלורסצנטיים בירוק. כעת אספו את העל-נוזל (supernatant) של תרבית התאים למבחנה קונית של 50 milliliter. העל-נוזל מכיל את חלקיקי הפסאודו-וירוס המדבקים.

תאים שייסחפו מהפלטה לא ישפיעו לרעה על ייצור הווירוס. כדי להסיר שאריות, סנטריפוג את העל-נוזל הווירוס ב-1500 G למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, מבלי להפריע למשקע, אסוף את העל-נוזל הווירוס תוך הקפדה להשאיר שוליים של כ-500 microliters של על-נוזל, והמשך לשלב הבא, שהוא ריכוז החלקיקים הווירוסליים 72 שעות לאחר הטרנספקציה.

ניתן לבצע איסוף שני אופציונלי של העל-נוזל (supernatant) הויראלי באמצעות אותה טכניקה לאחר איסוף המצב הויראלי. ניתן לרכז זאת על ידי הוספה של נפח אחד של תמיסת השקעה ויראלית של peg קרה (בטמפרטורת קרח) לכל ארבעה נפחים של על-נוזל בתוך מבחנת צנטריפוגה מפוליפרופילן בנפח 50 milliliters. הפוך את התמיסה כדי לערבב אותה.

אין להשתמש במכשיר וורטקס, ולאחר מכן יש לאחסן את התמיסה ללא ערבוע בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך עד 96 שעות. לאחר קירור של 12 שעות לפחות, סבב את התערובת בצנטריפוגה ב-1500 G למשך 30 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר הסבב בצנטריפוגה, חלקיקי הלנטי-וירוס שהשקילו באמצעות peggo יופיעו כשקע בצבע בז' או לבן בתחתית המבחנה.

כעת, הסירו את כל שאריות הנוזל באמצעות שאיבה זהירה, מבלי להפריע לחלקיקי הלנטי-וירוס שהשקיעו במשקע. לחלופין, הסירו את רוב הנוזל העליון (supernatant) והשעיקו את המשקע בנוזל העליון שנותר. לאחר מכן, העבירו את התרחוף לפרוביקט (Eppendorf tube) סטרילי בנפח של 2 ml וסבבו את הפרוביקט בצנטריפוגה מיקרוסקופית קרה למשך שתי דקות.

במהירות של 14,000 RPM, שאבו החוצה את supernatant שנותר והשעיקו מחדש את משקע חלקיקי ה-lentiviral בבופר סטרילי וקר (בקרח), ביחס של 1/10 עד 1/100 מהנפח המקורי. העבירו בזהירות את המשקע לתוך התמיסה באמצעות פיפטה ללא יצירת בועות, תוך שמירה על טמפרטורה קרה בכל עת. ודאו שהמשקע השועיק באופן מלא.

לבסוף, הכינו אליקוטות של 15 עד 25 µL של הדיו במבחנות קריוגניות סטריליות על קרח, ואחסנו את המבחנות בטמפרטורה של 70- °C. תהליך אריזה מוצלח יניב 10 מיליון עד 1,000 מיליון IFUs ל-mL עבור טרנסדוקציית וירוס בלוח תרבית של 24 בארות, עם 50,000 תאים לבער, וגדלו אותם למשך לילה בתנאי התרבית המוגדרים להם. התאים צריכים להיות בדרגת התמזגות (confluency) של 50 עד 70% לצורך טרנסדוקציה למטרות קביעת טיטר.

ניתן להשתמש בתאי HT 1080 כשורת תאי בקרה הקלה להדבקה (transduction). למחרת, יש לשאוב את המצע מהתאים. לאחר מכן, שלבו את מצע התרבית עם תמיסת ה-trans-ducks המרוכזת, כך שהריכוז הסופי של ה-trans-ducks יהיה 1x. הוסיפו 0.5 mL מהתמיסה המודבקת לכל באר המכילה תאי מטרה בצפיפות נכונה של 50% עד 70% קונפלואנסיות (confluency). הוסיפו וירוס לכל באר בדילולים הבאים: 1:100, 1:10 ודילול ישיר של 1:1.

הנגיף יכול להישאר במגע עם תאי המטרה למשך עד 72 שעות ללא החלפת המצע. לאחר 72 שעות, הפרו-וירוס ישתלב באופן יציב בגנום המארח ויבטא את הגן הרצוי. אם קיים ביטוי של סמן פלואורסצנטי שניתן להשתמש בו להערכת יעילות הטרנסדוקציה עם דילולות שונות של הנגיף, ניתן לכמת את מספר היחידות הזיהומיות באמצעות QPCR.

לאחר שערך הטיטר של הנגיף ידוע, חשבו את נפח הנגיף המתאים כדי להשיג את ריבוי הזיהום (MOI) הרצוי עבור תאי מטרה אחרים. מדידת הטיטר ובקרת ה-MOI מבטיחות עקביות בין ניסויים ובין הכנות נגיפיות שונות. הנגיף מוכן כעת לשימוש בניסויים נוספים.

צפיפות ההתחלה של תאי 2 9 3 TN הייתה קריטית להשגת אריזה ויראלית מוצלחת ביום הטרנספקציה. תאי 2 9 3 TN אלו היו בדרגת התמזגות (confluency) של בין 60% ל-80%. 24 שעות לאחר טרנספקציה מוצלחת עם וקטור לנטי המבטא GFP, נמצא כי לפחות 90% מתאי 2 9 3 TN הראו פלואורסצנציה ירוקה.

72 שעות לאחר ההחדרה (transduction), GFP המשיך להתבטא בתאי המארח HT 10 80. הדבר מעיד על כך שהסמיכה הלנטיוויראלית השתלבה באופן יציב בגנום המארח; החדרה של אותם תאי מארח בדילול של פי עשרה הובילה לירידה פרופורציונלית בביטוי של GFP, מכיוון שהקשר בין הטיטר הוויראלי לבין ביטוי גנים המתווך על ידי לנטיוויראלי הוא יחסי באופן ישיר.

לאחר השליטה בטכניקה זו, ניתן לבצעה לאורך חמישה ימים, במשך כשעה עד שעתיים ליום, במידה שהיא מבוצעת כהלכה. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובהBאופן אריזה יעיל ובטוח של חלקיקי נגיף זיהומיים פונקציונליים, וכיצד לבצע טרנסדוקציה מוצלחת של תאים באמצעות הנגיף. זכרו כי עבודה עם lentivirus עלולה להיות מסוכנת, ויש לנקוט באמצעי זהירות כגון עבודה במכסה של תרביות רקמות ברמת BSL 2.

יש להקפיד תמיד על לבישת חלוק מעבדה וכפפות בעת ביצוע הליך זה.