Mesoscopic Fluorescence טומוגרפיה עבור In-vivo הדמיה של פיתוח תסיסנית

על מנת לבצע שחזורים של איברים מתפתחים ב-Drosophila melanogaster, עלינו לקבוע את המודל הפרוגרסיבי המתאר בצורה הטובה ביותר את התפשטות האור בתוך הגלגל (pupa) עצמו. ההליך מתחיל בבחירת קדם-גלגל (pre pupa) לבן והדבקתו בקצהו של צינור קפילרי, כך שציר הקדמי-אחורי של הגלגל מונח במקביל לצינור. צינור קפילרי קטן ממולא בצבע פלואורסצנטי ומוחדר למעטפת הגלגל.

לאחר כוונון מדויק של הצירים, הבובה מסובבת ב-360 מעלות. תמונות נרכשות מזוויות שונות. נתוני התאורה הפלורסצנטית התו soon-trans המורכבים משמשים לקביעת המודל הקדמי שישמש לדימוי התפתחות האיבר.

שלום, שמי קלאודיה ואני נמצאת במרכז לביולוגיה מסייעת בבית החולים הכללי של מסצ'וסטס, בית הספר לרפואה של הרווארד. אני אולה פטו מהמעבדה של פראמאונט בבית הספר לרפואה של הרווארד, ואני דניאל רוזנסקי מהמכון לדימות ביולוגי ורפואי באוניברסיטה הטכנית של מינכן ובמרכז הלימן מינכן. היום נדגים לכם הליך לשחזור תלת-ממדי של הגוף השלם ב-*Oph Melano Casta*.

אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדה שלנו לצורך ויזואליזציה in vivo של איברים מתפתחים במהלך שלב תלמידי העין. אז בואו נתחיל. לפני שמתחילים, שימו לב שאין סרטון נלווה שיש לצפות בו לפני סרטון זה, שבו חלק מההיבטים הטכניים של טומוגרפיה של הפניסה אופטית מוסברים בפירוט רב יותר מאשר כאן.

בנוסף, הסרטון השני מסביר דימוי של רקמות או איברים שהוכנו מבעלי חיים גדולים יותר. עבור כל הניסויים המפורטים בסרטון זה, יעשה שימוש בטרנסגנים של drosohila. אלו הם EL A gal four המובע בבלוטות הרוק, apteris gal four, המובע ברקמות המקדימות של הזחל עבור הכנף וחזה הבוגר, והטרנסגן המייצר חלבון פלואורסצנטי.

בתגובה ל-gal four הנקרא U-A-S-G-F-P ו-white 1118, הזכרים שאינם פלואורסצנטיים המשמשים כביקורת ונושאי את ה-UAS transgenes מוכשבים לנקבות בתולות הנושאות את ה-GAL four transgenes כדי להשיג ביטוי ספציפני לרקמות של GFP. ההכרעות מוקמות משמונה עד 10 נקבות בתולות וזכרים על מצע זבובים סטנדרטי עם פיזור של שמרים למאפה. המבחנות מאוחסנות בטמפרטורה של 25 °C בתוך אינקובטור לח עם מחזור של 12 שעות אור וחושך.

יומיים לאחר תחילת ההכלאה, ההורים מועברים למבחנה נקייה, וחמישה עד שישה ימים מאוחר יותר, PUI יחילו את המבחנה ב-PrepU לבן. אלו נבחרים על סמך ביטוי GFP תחת מיקרוסקופ דיסקציה פלורסצנטי. בחירה של pre pui לבנים מבטיחה שלב התפתחותי מדויק של בעלי החיים, כיוון שהם נשארים לבנים למשך כשעה אחת.

לאחר התבגרת האישונים, הם הופכים לפיגמנטיים או חומים. אישונים המבטאים GFP נאספים בעדינות מהמבחנות באמצעות מכחול רטוב ומונחים בטיפת מים או PBS בתוך צלחת פטרי, אך יש לנקות אותם משאריות של חומרים עם פלואורסצנציה עצמית. באמצעות המכחול, הם מוכנים כעת לדימות טומוגרפי.

אם ה-PrepU זקוק להמשך הבשלה כדי להגיע לשלב ההתפתחותי הנכון, ניתן להשאירם בצלחת פטרי עם נייר סופג רטוב או במבחנה נקייה למזון. פעולה זו תבטיח לחות מספקת והתפתחות תקינה לצורך הדימיון. יש להדביק את ה-PrepU לדופן הפנימית של צינור נימי מזכוכית בעובי 800 מיקרון.

מרחו דבק מהיר (super glue) על הקצה האחורי של הפופה. כוונו את המשטח המודבק של הפרה-פופה אל תוך הצינור, כך שציר הגב-בטן של הזבוב יהיה מקביל לצינור. החלק הקדמי של בעל החיים יבלוט מחוץ לצינור הנימי. כעת קבעו את הצינור הנימי על הבמה המסתובבת של המיקרוסקופ.

במיקום אנכי, כווננו את ציר ההטיה של הבמה המסתובבת כך שציר הסיבוב של המבחנה יהיה מקבילי לעמודי הפיקסלים של ה-CCD המצלם. לאחר כיוון מדויק של מיקום הזבוב, ניתן להתחיל בהדמיה. בדוגמה זו, יבוצעו הדמיות של בעלי בלומי רוק פלורסצנטיים; זבובים המבטאים GFP בבלומי הרוק שלהם ניתן להפיק מהכלאה בין מאגרי EAG four ו-U-A-S-G-F-P.

נתחיל עם טרום-בובה מקובעת; נאיר את הטרום-בובה באמצעות קרן עירור ואסוף את אות הפלואורסצנציה של GFP. בתאורה נגד-אור (transillumination), סובב את הטרום-בובה 360 מעלות סביב הציר האנכי שלה ורכוש את תמונות התאורה נגד-האור. כל תמונה תואמת לסיבוב של 10 מעלות.

זמן הרכישה הכולל תלוי בכמות הפלואורסצנציה ובעוצמת קרן העירור. זמנים טיפוסיים הם בסדר גודל של דקה אחת. בדוגמה זו, יבוצע דימוי של בובת DSO המבטאת GFP בדיסקיות הדמיוניות (imaginal discs) של הכנף.

ניתן לאסוף בובה זו מבקבוקון של הכלאה בין מקוניות Aus GAL four ל-U-A-S-G-F-P. את הקדם-בובה מקבעים כפי שתואר בעבר. עם זאת, מכיוון שזמן הדמיון בניסוי זה הוא כשמונה שעות, קריטי שהסביבה תישאר לחה ובטמפרטורת החדר כדי למנוע התייבשות ומות של בעל החיים. כדי למנוע כיבוי של פלואוריזציה ברקמה המבוקשת, ממוקם תריס מעל קרן העירור, וכן כדי להבטיח שבעל החיים לא יישרף על ידי קרן הלייזר; כפי שנעשה קודם לכן, מאירים באמצעות קרן העירור ואוספים את אות הפלואורסצנציה של GFP באמצעות תאורה בתמסורת.

הטסבון (pre pupa) מסובב לחלוטין סביב הציר האנכי שלו. במהלך איסוף הנתונים, הסיבוב נמשך דקה אחת בלבד וחוזר על עצמו במרווחי זמן שונים. כדי ליצור סדרת תמונות של הכנפיים במהלך ההתפתחות בשיטת time lapse, ניתן לאסוף נתונים למשך שש שעות לפחות בקצב של 100 תמונות לשעה.

חיוני לשלוט בחשיפה הכוללת לאור באמצעות תריס זה כדי למנוע נזק או פוטו-بلیச்சிנג (photo bleaching). סרטון זה מציג תמונות שנרכשו בין שלב ה-PrepU לבין רפלקס הניתוק של הראש מהאישון. בעת שחזור התמונה התלת-ממדית, קיימת פיזור קדימה חזק שיש להביאו בחשבון, ושאינו ניתן לקירוב באמצעות דיפוזיה.

על מנת לבצע את השחזור, יש לקבוע מודל פיזור קדימה של התפשטות אור. לצורך הפשטות, נתעלם מבליעה. כמות הפיזור נבדקת באופן ניסיוני. לשם כך, מושחלת אובייקט זר בעל פלואורסצנציה סטנדרטית אל תוך פרה-פופה לבנה 1118 שאינה פלואורסצנטית, אשר נסרקת לאחר מכן כדי להפיק את נתוני מודל הפיזור הקדימה. התחילו במילוי של צינור קפילרי מסיליקה בקושי 100 מיקרון בצבע פלואורסצנטי PS 5.5.

באמצעות פעולת נימיות, דחפו את צינור הנימיות אל תוך הגולם בזווית של 45 מעלות לציר הקדמי, רכבו את ה-PrepU בתוך צינור נימיות ומקמו אותו כראוי על הבמה המסתובבת כפי שתואר בעבר. כעת, האירו את הטרי-גולם באמצעות קרן לייזר לעירור עם עדשה בעלת מספר מפתח נמוך ואספו תמונות של תאורה פלורסצנטית חודרת של הטרי-גולם. כפי שתואר בעבר, נעשה שימוש בתוכנת MATLAB כדי להתאים את הנתונים למודל קדימה תיאורטי מפורש. כדי להקל על תהליך השחזור, נבחר קירוב ה-firm e למשוואת התובלה, שכן הוא מתאר את משטר הפיזור הקדמי ומתאים גם לנתונים הניסיוניים.

לאחר קביעת המודל הפרוגנוסטי (forward model) הנכון, ניתן לשחזר את בלוטות הרוק ולהשיג שחזורים טומוגרפיים של תהליכים לאורך זמן (time lapse). אם בכוונתכם להשתמש בטומוגרפיה של מרחב פתוח (free space tomography), ניתן להגדיר גם אלגוריתמי קונפיגורציה להתאמת מקדמי שבירה (index matching). ראשית, נציג שחזור תלת-ממדי של בלוטות הרוק בשלב מוקדם של ההתפתחות.

להשוואה, צביעה היסטולוגית של בלוטות הרוק מראה כי השחזורים תואמים היטב להיסטולוגיה. סרט time lapse זה של התפתחות דיסקים אימגינליים של הכנף הופק מדגימה חיה אחת. להשוואה, צביעה היסטולוגית של דיסק הכנף באותן נקודות זמן מראה כי השחזורים תואמים היטב להיסטולוגיה.

הדגמנו בפניכם כיצד לבנות מערכת לדימות מבנים תלת-ממדיים בתוך organisם in vivo, לאורך זמן. דבר זה מאפשר לעקוב אחר המורפוגנזה ב-Drosophila, ולעקוב אחר התפתחות הכנפיים במשך שש שעות רצופות. בעת ביצוע הליך זה, חיוני לבחור את המודל הקדימה (forward model) הנכון עבור התפשטות האור בתוך drosophila.

ניתן להשתמש בשיטה זו בשילוב עם טכניקות היסטולוגיות כדי לשפוך אור על התפתחות איברים במהלך שלבי התפתחות העוברי, וניתן להתאימה למחקר של אורגניזמים שונים בגודל דומה. זהו זה. תודה לצפייה ובהצלחה בניסויים שלכם.