טיהור אוכלוסייה תאים ספציפיים על ידי מיון פלואורסצנטי תא פעיל (FACS)

שלום, אני הופ קמפבל, מומחית לציטומטריית זרימה ממכון לחקר הדם במרכז הדם של ויסקונסין. שלום, אני STR Baso, סטודנט לתואר מתקדם במעבדתה של ד"ר בוני דיטר. גם אני ממכון לחקר הדם במרכז הדם של ויסקונסין.

היום נבצע הליך לבידוד תאים באמצעות מיון תאים מופעל פלואורסצנציה (fluorescent activated cell sorting). אנו משתמשים בהליך זה במעבדה כדי לחקור את תפקודם של לימפוציטים ואוכלוסיות של תאי מיאלואיד. בואו נתחיל.

בפרוצדורה זו יבצעו הפרדה של תאי B ותאי CD4 T מתוך ספלנוציטים של עכבר. יש לחשב את מספר תאי המטרה ההתחלתי בהתבסס על מספר התאים הדרוש ועל שיעור ההשבה של המכונה בשיטה זו. שיעור ההשבה הטיפוסי עבור תאי B ותאי CD4 T הוא 85% עד 90%. אוכלוסיית הספלנוציטים ההתחלתית מורכבת מכ-60% עד 70% תאי B ומ-20% עד 30% תאי T.

לפיכך, אם תתחילו עם 100 × 10⁶ תאים, תוכלו להפיק 50 עד 60 מיליון תאי B ו-20 עד 30 מיליון תאי T לפני תחילת ה-facts. יש להניח את התמיסות והריאגנטים הדרושים לפרוטוקול על קרח. אלו כוללים בופר צביעה המורכב מ-phosphate buffered saline עם 3% fetal calf serum, בופר סספנסיה המורכב מ-25 millimolar HEPs שהוכנה ב-Hank's balanced salt solution או HBSS המכיל 3% fetal calf serum, תמיסת 25 millimolar HEP B שהוכנה ב-fetal calf serum, נוגדני צביעה וחרוזי פיצוי (compensation beads).

פרוטוקול זה דורש גם את האספקה והריאגנטים הבאים: מבחנות קוניות של 15 milliliter, מבחנות זרימה מפוליסטירן או פוליפרופילן של 12 על 75 millimeter. מסננת תאים מניילון, trypan blue, והמוציטומטר. יש להכין מראש גם מבחנות איסוף למיון לצורך ביצוע פעולה זו.

העבירו 300 µL של תמיסת HEPES FCS למבחנות זרימה או 1 mL של תמיסת HEPES FCS למבחנות קוניות של 15 mL. יש להניחן על קרח עד לתחילת תהליך האיסוף. התחילו ביצירת תליה של תאים בודדים (single cell suspension) של אוכלוסיית התאים הרצויה.

אם התאים שהבודדו באמצעות הליך זה יעברו תרבית, יש לבצע את כל תהליך הכנת התאים במנדף לתרביות רקמה. בשימוש בטכניקה סטרילית, יש לשטוף את התאים פעם אחת על ידי הוספת תמיפת צביעה קרה (בטמפרטורת קרח) והשעיה מחדש של התאים על ידי היפוך המבחנה מספר פעמים.

לאחר מכן, סנטריפוגו את התאים למשך שבע עד שמונה דקות במהירות של כ-250 ×g בטמפרטורה של 4 °C. תנאי השטיפה עשויים להשתנות בהתאם לסוג התאים ולריכוזם. עבור cytes, שטפו עד 200 × 10⁶ תאים עם 10 milliliters של בופר צביעה.

הסר בזהירות את הנוזל העליון באמצעות שאיבה, כך שהמשקע התאי יישאר שלם. לאחר מכן, השהה מחדש את התאים בבפר staining buffer קר בקרח בריכוז של עד 50 × 10⁶ ל-100 µL. השהה מחדש את המשקע התאי על ידי נקישה של המבחנה או ערבוב עדין ב-vortex.

לאחר מכן, העבירו מ-0.25 עד 1×10⁶ תאים מששת התאים לשפופרת זרימה חדשה מפוליסטירן או מפוליפרופילן במידות 12×75 מילימטר על קרח. השאירו דגימה זו בצד לשימוש מאוחר יותר כדגימת ביקורת לא צבועה. לשפופרת הראשונה, הוסיפו נוגדנים ראשוניים לתלי התאים כדי להגיע לריכוז הסופי הרצוי. כאן נעשה שימוש בנוגדנים anti-B220 המשורשריים ל-PE Texas Red לצביעת תאי B, בעוד שנוגדנים anti-TCRβ המשורשריים ל-ZEI ו/או נוגדנים anti-CD4 המשורשריים ל-700 משמשים לצביעת תאי T. ערבבו על ידי נקישה על תחתית השפופרת או בערבוב עדין.

ערבוב במכשיר וורטקס (Vortexing), לאחר מכן הנחת התאים על קרח ודגירה בחושך למשך 20 עד 30 דקות. לאחר הדגירה, שטפו את התאים המסומנים באמצעות Resus, על ידי השעייתם ב-10 milliliters של בופר השעיה קר, וסבוב בצנטריפוגה כפי שבוצע קודם לכן, לאחר הסרה זהירה של הנוזל העליון (supernatant). חזרו על שלב זה כדי לשטוף את התאים פעם שנייה.

לבסוף, השהו מחדש את התאים בבফার תליה (suspension Buffer) קר בקרח. אם הנוגדנים הראשוניים אינם מצומדים ישירות לפלואורופור, הוסיפו נוגדנים משניים מסומנים או strep AVID בצמידות לתליה של התאים, ושוב, דגרו את התאים בקרח בחשכה למשך 20 עד 30 דקות לאחר הדגירה. שטפו את התאים פעמיים בבפר תליה קר בקרח.

לאחר הפשרה, השעו את התאים בבופר השעיה קר (בטמפרטורת קרח). קבעו את ריכוז התאים ואת חיוניותם באמצעות צבע חיוני כגון tripan blue והמוסייטומטר. התאימו את ריכוז התאים ל-10 עד 20 כפול 10⁶ תאים למיליליטר על ידי הוספת בופר השעיה, וזאת כדי למנוע סתימה של מכשיר ה-fax באמצעות צברים של תאים שייתכן ומתו במהלך הבידוד.

הליך וצביעה. סננו את התאים דרך מסננת טפטוף מיד לפני תחילת פרוטוקול המיון. יש לבחור את גודל הנקבים של המסננת בהתאם לסוג התאים; עבור ציטים (cytes) נעשה שימוש במסננת עם גודל נקבים של 40 micrometer.

אספו את התאים המסוננים לשפופרת קונית של 15 ml או לשפופרות זרימה של 12 על 75 מילימטר, בהתאם לנפח. הניחו את התאים על קרח בזמן שהציטומטר מוגדר להליך המיון. אם משתמשים ב-BD comp beads כביקורות חיוביות של צבע בודד, הכינו שפופרת ביקורת אחת עבור כל צבע שנעשה בו שימוש במבחן, ובנוסף שפופרת ביקורת שלילית ללא צבע.

לאחר ערבול יסודי ב-vortex של תרחיפי החרוצים, הוסיפו טיפה אחת מכל אחד מתרחיפי החרוצים השליליים והחיוביים ל-100 µL של בופר תרחיף עבור כל צבע שנעשה בו שימוש ועבור הביקורת השלילית. לאחר מכן, הוסיפו 1 µL של הנוגדן המסומן לכל מבחנה של ביקורת חיובית. בניסוי זה, מבחנה אחת מוכנה באמצעות הנוגדנים PE Texas'Red B two 20.

ערבבו נוגדנים מסוג ETCR beta ונוגדנים מסוג lor 700 CD four על ידי נקישה על תחתית המבחנות, והדגירו למשך 15 עד 30 דקות בחושך ובטמפרטורת החדר. שטפו את החרו지를 פעם אחת עם 2 mL של באפר צביעה וסבבו בצנטריפוגה ב-200 Gs למשך 10 דקות. הסירו את העלייה על ידי שאיבה והשביו את משקע החרוזים ב-200 עד 500 µL של תמיסת צביעה.

הגדרת הבאפר של ציטומטר הזרימה משתנה בהתאם ליצרן ויש לבצעה אך ורק על ידי כוח אדם שעבר הכשרה מתאימה. הליך מיון התאים כאן יבוצע באמצעות BD defects aria. לפני המיון, יש לבחור את הדיזה המתאימה בהתאם לסוג התאים המיועדים למיון.

הגדלים הזמינים עבור אזור העובדות הם 70 micrometers, 100 micrometers ו-130 micrometers. גודל הדיזה צריך להיות לפחות פי שלושה מגודל התא המיועד למיון; עבור לימפוציטים, נבחרת הדיזה בגודל 70 micrometer. ניתן לבצע מיון תאים אספטי באמצעות אפשרות המיון האספטי של המכשיר.

בשימוש באפשרות זו, נתיב המעטפת כולו עובר דה-קונטמינציה באמצעות 70% ethanol בהתאם להוראות היצרן. יש להקפיד להחליף את מסנני המעטפת ולהחליף את ה-PBS ב-PBS סטרילי. ברגע שהציטומטר מוכן לפעולה, יש להניח את מבחנות האיסוף שקוללו מראש ומכילות heaps FCS במכשיר האיסוף המתאים.

מכשירי איסוף זמינים יכולים להכיל עד שני מבחנות קוניות של 15 milliliter. ארבעה מבחנות של 12 על 75 millimeter או ארבעה מיקרו-מבחנות. השתמשו במבחנות של 12 על 75 millimeter לאיסוף של פחות מ-1.5 × 10⁶ תאים ובמבחנות קוניות של 15 milliliter לאיסוף של 1.5 × 10⁶ עד 4.5 × 10⁶ תאים.

הנח את התקן האיסוף המתאים לתוך תא איסוף המיון. עבור מייונים רב-צבעיים, הפנה את זרמי הצד אל התקן האיסוף שהותקן. ראשית, יש לכלול את הציטומטר כדי לפצות על חפיפה ספקטרלית בין הגלאים.

הדוגמה המוצגת כאן ממחישה את החפיפה בין ספקטרומי הפליטה של fit E ו-pe. חפיפה זו, המוצגת באזור המוצל כהה, נקראת spillover. במקרה זה, spillover של PE יזוהה בערוץ של fit E, ו-spillover של fit e יזוהה בערוץ של PE.

יש לתקן את חפיפת האותים (spillover) זו על מנת לבטל את הפלואורסצנציה השיורית של פלואור אחד בערוץ אחר. התהליך של תיקון חפיפת האותים נקרא קומפנסציה. כדי לבצע קומפנסציה ידנית, השתמש בתוכנת ציטומטריה להגדרת תבנית הכוללת תרשים דו-משתני להצגת פיזור קדמי FSC ופיזור צדי SSC, והיסטוגרמה אחת עבור כל פלואור שבו ייעשה שימוש.

השיטה להגדרת תרשימים אלו משתנה בהתאם לתוכנה. הכניסו את מבחנת הבקרת השלילית לפתח הטעינה של הציטומטר והתחילו ברכישת נתונים בזמן הרצת הדגימה. כווננו את ה-FSC וה-SSC כדי למקם את האוכלוסייה המבוקשת בתוך הסקאלה.

לאחר מכן, התאימו את הגדרות ה-PMT של הפלואורסצנציה כך שאוכלוסיית השליליים או האוטופלואורסצנציה ימוקמו בחלק השמאלי ביותר של ההיסטוגרמה. רשמו את התוצאות של מבחורת ביקורת השליליים. הוציאו את מבחורת ביקורת השליליים מפתח הטעינה של הציטומטר והחליפו אותה במבחורת ביקורת החיוביים הראשונה.

כעת התחילו ברכישת הנתונים. חזרו על תהליך זה עבור כל אחת מבחילות הביקורת החיובית תוך רישום הנתונים עבור כל מבחנה. עבור כל ביקורת חיובית, שרטטו שער מרווח (interval gate) או תיבה סביב האירועים שנרשמו בהיסטוגרמה.

לאחר מכן, שרטטו שער מרווח (interval gate) נוסף בחלק השלילי של ההיסטוגרמה. בעת ביצוע פיצוי ידני, התחשבו בכל פלואור ששימש בניסוי על ידי כוונון החציון של הדגימות החיוביות עד שיהיה שווה לחציון של הדגימות השליליות. כדי לכוונן את החציון, שנו את ערכי החפיפה הספקטרלית, כלפי מעלה או מטה, עד שהחציונים עבור כל פרמטר פלואורסצנטי יתאימו ככל הניתן.

בעזרת ההגדרות שנקבעו עם דגימות הביקורת החיובית והשלילית, הכינו את תהליך המיון על ידי קביעת הגדרות ה-gait עבור הדגימה הניסויית. הכניסו את מבחנת התאים המיועדים למיון לפתח הטעינה של הציטומטר והתחילו ברכישת נתונים במהירות של 9 עד 10,000 אירועים לשנייה. בחרו בגרף פיזור (dot plot) להצגת פיזור קדמי (forward scatter) לעומת פיזור צדי (side scatter).

פיזור קדימה (Forward scatter) מהווה אינדיקטור כללי לגודל התא וממוקם על ציר ה-x, בעוד שפיזור צידי (side scatter) מהווה אינדיקטור לגרנולריות התא וממוקם על ציר ה-Y. כעת הגדירו שער (gate) עבור האוכלוסייה הרצויה. לאחר שנקבעו השערים, ודאו שטמפרטורת פתח הטעינה של הסייטומטר מוגדרת ל-4 °C.

לאחר מכן, הכניסו את מבחנת הדגימה הניסויית לפתח הטעינה. לחצו על אפשרות המיון (sort) והתחילו באיסוף; יש להניח את מבחנות האיסוף על קרח תוך כדי מילויין. המשיכו במיון עד לאיסוף המספר הרצוי של תאים או עד שתוכן מבחנת הדגימה יסתיים.

לאחר מכן, הפסיקו את המיון על ידי לחיצה שוב על כפתור המיון והוציאו את הדגימה מפתח הטעינה. לאחר מכן, הניחו את מבחנת האיסוף ישירות על פתח הטעינה של הציטומטר ורכשו 500 עד 1000 אירועים. באמצעות אותן הגדרות ששימשו למיון של T cells, תהליך המיון העלה את הטוהר מ-21% ל-99%. עבור B cells, אוכלוסיית ה-B cells התחלתית של 5% עלתה ל-98% לאחר המיון.

ראינו כעת כיצד לטהר אוכלוסיות של תאי b ותאי t מתוך לוקוציטים באמצעות fax. זכרו כי ניתן להשתמש ב-facts לטיהור של כל אוכלוסיית תאים, בתנאי שניתן להפיק תרחיף של תאים בודדים ושישנם נוגדנים מתאימים. בנוסף, ניתן לטהר בקלות תאים המסומנים גנטית במדדים פלואורסצנטיים ללא שימוש בנוגדנים.

בנוסף, זכרו תמיד להשתמש בביקורות המתאימות לניסוייכם, ובדקו תמיד את תצורת הלייזר של הציטומטריה הזרימתית כדי לוודא שאתם משתמשים בفلואורוכרומים הנכונים, וודאו שאתם משתמשים בשערים (gates) מתאימים כך שהם יקיפו את האוכלוסיות שלכם כראוי. זה הכל. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.