חזותי Cell ל-תא העברה של HIV באמצעות המשובטים פלורסנט של HIV מיקרוסקופיה confocal חיים
7 באוקטובר 2010
ניסוי זה הוא מדריך חזותי עבור ניצול שיבוט מולקולרי פלואורסצנטי של HIV עבור לחיות ניסויים הדמיה confocal.
נוהל זה משתמש בדימות תאים חיים כדי להמחיש ויזואלית את ההעברה של HIV המסומן ב-GFP דרך סינפסות וירולוגיות בין תאי T של חתולי Jerk המבטאים HIV לבין תאי T ראשוניים שאינם נגועים. בדיקת ההעברה מתא לתא מתחילה בהחדרה (טרנספקציה) של HIV gag GFP לתאי T של חתולי Jerk, שהוא שיבון פלואורסצנטי זיהומי של HIV-1; תאי חתולי ה-Jerk שעברו טרנספקציה מבטאים HIV gag GFP. לאחר מכן, מערבבים את תאי חתולי ה-Jerk עם תאי T ראשוניים שאינם נגועים ומסומנים ב-CMTMRed, ומטעינים אותם לתא דימות שבו ניתן לצפות בהעברה של HIV המסומן ב-GFP דרך הסינפסה הוירולוגית.
הנתונים המתקבלים מנותחים באמצעות תוכנה לניתוח תמונות כדי לחשוף את פרטי העברת HIV דרך סינפסות וירולוגיות של תאי T. שלום, שמי בנג'מין דייל מהמעבדה של בן צ'ן במחלקה לרפואה בבית הספר לרפואה של Mount Sinai. שמי גרג מקנרני מהמעבדה של ד"ר תומאס יוזר במרכז NSF לביופוטוניקה במרכז הרפואי של uc Davis.
ואני דיאנה תומפסון, גם מהמעבדה של ד"ר Thomas Huser. היום נדגים לכם פרוצדורה לוויזואליזציה של מעבר תא-לתא של HIV-1 באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית חיה. בפרוצדורה זו, תאי Jurkat עוברים טרנספקציה עם שיבוט מולקולרי זיהומי של HIV; רק אנשי מעבדה מיומנים העובדים במעבדה מאושרת לבטיחות ביולוגית.
ניתן לבצע את הפרוטוקול המוצג כאן בחדרי תרבית רקמות ברמת ביו-בטיחות 2+ או 3. עבודה עם HIV זיהומי במתקני דימות חייבת להיות מאושרת על ידי המשרד המקומי לבטיחות ביולוגית של המוסד. יש לתחזק את תאי ה-jerk cat שישמשו כתאי תור בריכוז שבין 2×10⁵ ל-8×10⁵ תאים למילליליטר.
בתרבית תאי jerk cat, ריכוז תאים במצע העולה על 8×10⁵ תאים למוליליטר גורם לירידה ביעילות הטרנספקציה. כדי להתחיל את הפרוצדורה, בצע טרנספקציה של 5×10⁶ תאי jerk cat עם הפלסמיד הווירוסלי HIV gag IGFP באמצעות שיטת ה-amax nucleofection כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב המצורף, ואפשר לתאים להתאושש למשך הלילה. תאים חד גרעיים של דם היקפי (PBMC) מופקים משכבות buffy coats של דם אנושי מלא באמצעות סבב צנטריפוגה במדרג צפיפות של FICO.
תאי T ראשוניים חיוביים ל-CD4 מופקים מתאי דם פריפריים חד גרעיים (PBMCs) באמצעות סלקציה שלילית באמצעות קיט לבדילת תאי T חיוביים ל-CD4. תאי ה-T החיוביים ל-CD4 שנבחרו באופן שלילי נאספים מעמודה מגנטית ומגודלים ב-PMI שלנו עם 10% FPS, המועשר ב-10 units/mL של recombinant human IL-2. ניתן גם לחלק את תאי ה-T הראשוניים החיוביים ל-CD4 המבודדים למנות ולהקפיא אותם בעזרת מכלים להקפאה קריוגנית. מכלי ההקפאה מונחים במקפיא של 70°C- למשך שלוש עד ארבע שעות לפחות.
לאחר מכן מעבירים את התאים לחנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך. כעת, כאשר תאי ה-Jurkat עברו טרנספקציה ותאי ה-T הראשוניים חיוביים ל-CD4 המהווים את היעד בודדו, יש להמשיך לניקוי ולסימון של התאים ביום שאחרי הטרנספקציה. תאי ה-Jurkat מבטאים כעת את מבנה ה-HIV הפלואורסצנטי המדבק.
בעת טיפול בדגימות זיהומיות, אנו לובשים חלוק מעבדה עם סגירה קדמית ושני זוגות של כפפות. הסר את השאריות התאיות מהתאים שעברו טרנספקציה באמצעות סבב צנטריפוגה מעל תווך fial high pack density. ראשית, העבר 1.5 milliliters של fial pack לתחתית של מבחנה קונוית בנפח 15 milliliters.
לאחר מכן, כסו בעדינות את חומר הגרדיאנט בתאי jerk hat שעברו טרנספקציה בנפח של 5 mL של מדיום PMI שלנו. בנקודה זו, תאי ה-jerk hat שעברו טרנספקציה מסוגלים לייצר HIV זיהומי. לכן, יש לחטא את כל קצות הפ pipette שבאו במגע עם התאים המבטאים HIV בתמיסת אקונומיקה בריכוז 10%.
לפני ההשלכה למכל בתוך קבינת הבטיחות הביולוגית, סגרו את השפופרת במכסה, רססו את החלק החיצוני של השפופרת בתמיסת 70% ethanol ונגבו בעזרת נייר Kim wipe יבש. צנטריפוגו את התאים ב-400 Gs למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר כאשר הבלם (brake) כבוי. לאחר הצנטריפוגה, השתמשו בפיפטה כדי להוציא בזהירות את התאים מממשק המדיום והעבירו אותם לשפופרת קונית חדשה של 15 milliliter. דללו את התאים במדיום PMI שלנו לנפח כולל של 15 milliliters וצנטריפוגו ב-300 GS למשך 10 דקות.
בטמפרטורת החדר, נשעה את המשקע בשלושה מיליליטר של מצע גידול jerk hat ונעבירו לבאר בנפח של שני סנטימטר בלוח של שש בארות. נניח את הלוח באינקובטור לתרביות רקמה עד למועד השימוש למחרת. בערב אותו היום, נסמן את תאי ה-T הראשוניים החיוביים ל-CD4 המשמשים כתאי מטרה, כדי להבדיל בינם לבין תאי התורם. ראשית, נשקיע 4x10⁶ תאי T ראשוניים חיוביים ל-CD4 על ידי סבוב ב-400 Gs למשך 10 דקות.
לאחר מכן שטפו את התאים עם 5 mL של PBS והשעיו אותם שוב. השעיו את התאים ב-2 mL של PBS, הוסיפו cell tracker orange עד לריכוז סופי של 1.5 µM והדגירו בטמפרטורה של 37 °C למשך מספר דקות. עם סיום ההדגרה של התאים, הוסיפו 8 mL של מצע גידול chica מלא וסובבו בצנטריפוגה ב-400 ×g למשך 10 דקות.
יש להשעות מחדש את התאים בשלושה מיליליטר של מצע גידול מלא המועשר ב-10 units per milliliter של IL two ולהניח באינקובטור לתרביות רקמה למשך הלילה. לאחר הדגירה למשך הלילה, תאי התור ותאי המטרה מוכנים לניסוי העברה מתא לתא. לפני הקמת ניסוי ההעברה מתא לתא, יש להכין את תא הדמיון כדי לבפר את הפלטפורמה מפני תנודות טמפרטורה בחדר.
כדי לחסום את אור הרקע בחדר, כיסוי שחור גדול נפרס על פני כל מערך החימום של המיקרוסקופ, ובכך נוצר כיס אוויר מבודד סביב המערכת. תא הדמיה נשמר בטמפרטורה יציבה של 37 °C באמצעות מחמם תרמוסטטי עם קצה תרמוקפל מסוג T המוצב לצד הדגימה לצורך משוב טמפרטורה. יש לחמם מראש למשך 30 דקות לפני הצבת הדגימה.
דימות קונפוקאלי עם דיסקה מסתובבת באמצעות מיקרוסקופ אופטי הפוך משמש ליצירת תמונות קונפוקאליות תלת-ממדיות של מעבר של HIV מתא לתא. כל החומרה והרכישה, כולל במת Z, נשלטות על ידי תוכנת and or IQ גרסה 1.8. הסריקה מבוצעת על ידי יחידה קונפוקאלית עם דיסקה מסתובבת מדגם CS U 10, המשתמשת בו-זמנית ביותר מ-800 נקודות קונפוקאליות כדי להגביר באופן דרמטי את קצב הסריקה ולהשלים את מהירותה. ה-CS U 10 מצומד למצלמת electron multiplying charged coupled device רגישה ביותר כדי לאפשר דימות מהיר בתנאי תאורה נמוכים, דבר המפחית הן את הפוטו-בליצ'ינג (photobleaching) והן את הפוטו-טוקסיות.
מקור אור הפלואורסצנציה הוא לייזר גז יוני ארגון-קריפטון רב-אורכי גל. מסנן אופטי הניתן לכיוונון מסוג AOTF משמש לבחירת אורכי הגל הרצויים, שבמקרה זה הם 488 ננומטר ו-568 ננומטר, תוך בקרה על עוצמתם כדי להפחית עוד יותר פוטובליצ'ינג (photobleaching) ולהאריך את זמן הדימוג. ה-AOTF חוסם במהירות את הלייזר לאחר כל חשיפה של 15 עד 30 מילישנייה כאשר המצלמה אינה רוכשת תמונות, ובכך מונעת חשיפה מיותרת בזמן שהתמונות מועברות ממצלמת ה-E-M-C-C-D למחשב.
אור הלייזר מוזן למערכת הדיסקה המסתובבת באמצעות מראת דיכרואי quad band 405 488 560 647; הפליטה הפלואורסצנטית מופרדת לפי אורך גל באמצעות מראת דיכרואי long pass של 560 nanometer עם מפליט תמונה (image splitter). הערוץ הירוק מסונן באמצעות מסנן band pass של 525/50 nanometer והערוץ האדום מסונן באמצעות מסנן band pass של 609/54 nanometer. שני הערוצים מוקרנים זה לצד זה על מצלמת ה-E-M-C-C-D.
בזמן שתא הדמיון מתחמם, הכינו את התאים לניסוי העברה מתא לתא. השתמשו ב-hemo cytometer כדי לספור את תאי ה-ette המבטאים HIV gag IGFP. הניחו את ה-hemo cytometer בתוך צלחת פטרי כדי למנוע חשיפה ישירה לתאים המבטאים את הנגיף.
שטפו את התאים באמצעות מצע ללא תלות בדו-תחמוצת הפחמן והשביו אותם בתמיסה לדימות תאים חיים בריכוז של 1-3 × 10⁷ תאים למילליליטר. השימוש במצע ללא תלות בדו-תחמוצת הפחמן מבטל את הצורך בתא סביבתי עם דו-תחמוצת הפחמן לצורך הדימות.
יש לספור, לשטוף ולתרחף מחדש את תאי ה-T הראשוניים המסומנים החיוביים ל-CD4, כפי שהודגם קודם לכן עבור תאי ה-Jurkat. לאחר מכן, כדי להתחיל את ההעברה מתא לתא, ערבבו 20 µL של תאי Jurkat שעברו טרנספקציה של HIV gag-GFP עם 40 µL של תאי T ראשוניים מסומנים החיוביים ל-CD4, והעמיסו 50 µL לתוך מיקרו-תא EBD חדיר לגז שעבר טיפול לתרבית רקמות. אטמו את התא באמצעות פקקים ואבטחו אותם על ידי עטיפת הממשק בין הפקק לתא ה-EBD ב-Parafilm.
נגבו את תא ההדמיה באמצעות מטלית כימית ספוגה ב-70% ethanol והניחו לו להתייבש מעט באוויר בתוך המנדף. העבירו את תא ההדמיה האטום בתוך מכל אטום כדי למנוע חשיפה מקרית. במידה והתא נפל במהלך ההעברה, מיד לאחר טעינת התאיים לתא ההדמיה של ה-IBD, התקינו את המכשיר על המיקרוסקופ.
צלם תמונות של זוגות תאים באמצעות עדשת שימור בשמן של 60 x 1.42 NA, שכן מפתח מספרי גבוה משפר משמעותית את הרזולוציה כדי למקסם את מהירות הרכישה עבור ערימות תמונות בתלת-ממד. חתך את אזור ההקלטה של מצלמת ה-EM CD לשטח המיידי של זוג התאים. בנוסף, מדרגת Z גדולה שבין 0.45 ל-0.75 מיקרומטר עשויה גם היא לסייע בהגברת מהירות הרכישה בתנאים אלה.
תמונות מוקלטות באופן רציף במרווחים של 20 עד 60 דקות. דימוג חוזר של אותה נקודה בדגימה יכול להימשך עד שש שעות עם פוטובליצ'ינג מינימלי בעת הרכישה. כל מקטע נתונים מורכב מעשרות אלפי תמונות שעשויות לתפוס נפח כולל של 5 עד 20 גיגה-בייט.
כדי להקל על ההעברה והניתוח של הקבצים הגדולים, כל קובץ מחולק ומיוצא כסגמנטים של קובץ תמונת TIFF בגודל של ג'יגה-בייט אחד. לניתוח התמונות שהושגו, ניתן להשתמש באחת מתוכנות ניתוח התמונות השונות. עיינו בפרוטוקול הכתוב המצורף לפרטים על ניתוח התמונות, כולל תיקון דהייה של העוצמה (intensity bleach correction) ומעקב אוטומטי וידני אחר gag puncta.
בתוך 10 עד 15 דקות מהערבוב, ניתן להבחין בתאי Jerk cat המבטאים HIV gag IGFP נצמדים לתאי T ראשוניים חיוביים ל-CD4 בדימוי. באמצעות קומפלקסים אלה ניתן להעריך את תנועת נקודות ה-gag בתאים מזוהמים וכן בתאי מטרה. לאחר היווצרות הסינפסה, בתוך 30 דקות עד שלוש שעות, ניתן להבחין בתנועה של נקודות gag IG FP לתוך תאי מטרה המסומנים ב-Cell Tracker.
הרגע הדגמנו כיצד להמחיש ויזואלית מעבר של HIV מתא לתא בין תאי T. בעת ביצוע הליכים אלו, חשוב מאוד לזכור להקפיד על כל אמצעי הזהירות של רמת ביו-בטיחות 2 פלוס (BSL-2+) או רמת ביו-בטיחות 3 (BSL-3) בעת טיפול בדגימות שנחשפו לתאים המבטאים HIV. כמו כן, זכרו להשתמש בתאי JCA מתוחזקים היטב וב-DNA נקי מאנדוטוקסינים כדי למקסם את הטרנספקציה.
זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.
סקירה כללית
ניסוי חזותי זה מדגים את השימוש בשיבוט מולקולרי פלואורסצנטי של HIV לצורך דימוי קונפוקאלי של תאים חיים. הפרוצדורה מתמקדת בהדמיה של העברת HIV המסומן ב-GFP דרך סינפסות וירוסולוגיות בין תאי T מסוג Jurkat המבטאים HIV לבין תאי T ראשוניים שאינם נגועים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי העצבים
- וירולוגיה
- ביולוגיה של התא
רקע
- טכניקות של דימות תאים חיים הן חיוניות למחקר של העברה ויראלית.
- המנגנון של HIV להעברה מתא לתא הוא קריטי להבנת הפתוגנזה שלו.
- מיקרוסקופיה קונפוקלית מאפשרת ויזואליזציה מפורטת של אינטראקציות תאיות.
- שיטות טרנספקציה משמשות להחדרת סמנים פלואורסצנטיים לתאים.
מטרת המחקר
- להדמיות של מעבר HIV בין תאי T.
- לניתוח הדינמיקה של העברת HIV דרך סינפסות וירוסים.
- לספק פרוטוקול למחקרים לצורך שחזור תהליך הדימוי.
השיטות שנעשה בהן שימוש
- טרנספקציה של תאי T מסוג jerk CAT באמצעות שיבט HIV פלואורסצנטי מידבק.
- בידוד וסימון של תאי T ראשוניים חיוביים ל-CD4.
- שימוש במיקרוסקופיה קונפוקלית עם דיסק מסתובב לצורך הדמיה.
- ניתוח של נתוני הדמיה באמצעות כלי תוכנה.
תוצאות עיקריות
- ויזואליזציה מוצלחת של מעבר HIV המסומן ב-GFP.
- תצפית מפורטת על היווצרות סינפסה וירולוגית.
- ניתוח כמותי של יעילות מעבר HIV.
- תובנות לגבי מנגנוני ההעברה של HIV מתא לתא.
מסקנות
- המחקר מספק שיטה מהימנה לצפייה בהעברת HIV.
- הממצאים תורמים להבנת הפתוגנזה של HIV.
- ניתן להתאים את הפרוטוקול למחקרים נוספים בתהליכי הדבקה נגיפית.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ויזואליזציה של מעבר HIV מתא לתא באמצעות שיבוטים פלואורסצנטיים ומיקרוסקופיה קונפוקלית חיה מאפשרת הפחתת סיכונים מכניסטית של תיקוף מטרות אנטי-ויראליות, על ידי תצפית ישירה על דינמיקה של חלבונים ויראליים בסינפסים וירולוגיים. גישה זו תומכת בביטחון חיזוי בשלבי הגילוי המוקדמים באמצעות כימות יעילות ההעברה וזיהוי אינטראקציות מאחסן-פתוגן הקריטיות להתערבות טיפולית. השיטה מספקת מערכת רלוונטית למחלה לסריקת מעכבי כניסה והרכבה, בהלימה לצרכי תיקוף מודלים פרה-קליניים במחקר הפתוגנזה של HIV.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר תצפית ישירה על הובלת חלבון ה-Gag של HIV דרך סינפסות וירולוגיות, לצורך תיקוף השערות מכניסטיות לגבי העברה מתא לתא.
- ערך תפעולי: מספק מדדים כמותיים של יעילות ההעברה הוויראלית לצורך הערכת מעורבות המטרה במערכות של סריקת מעכבים.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- ערך מדעי: מייצר נתוני דימוי סטנדרטיים וניתנים לשחזור כדי לתמוך בפיתוח בדיקות עבור תרכובות החוסמות יצירת סינפסה נגיפית או מעבר חלבונים.
- ערך תפעולי: משתמש בתאים חדירים לגז ובקרת טמפרטורה יציבה כדי לאפשר דימוי חי ארוך טווח לצורך ניתוח קינטי של השפעות מעכבים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מציע מערכת רלוונטית למחלה לבחינת הפתוגנזה של HIV בתאי T ראשוניים, ובכך תומך בהתאמת סמנים ביולוגיים לעיכוב ההדבקה.
- ערך תפעולי: מסייע בהמשכיות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני, באמצעות ויזואליזציה של השפעות תרופות על התפשטות נגיפית במודלים של תאים בעלי רלוונטיות פיזיולוגית.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה ועד לזיהוי מובילים (leads), על ידי אספקת תוצאות כמותיות המבוססות על ויזואליזציה של מעבר HIV, המנחות החלטות של go/no-go לגבי מעכבי חדירה והרכבה.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות של דינמיקה של חלבונים ויראליים ובבירור מסלולים בסינפסה הווירולוגית.
- סריקה: מספק מערכות ביולוגיות סטנדרטיות, מוכנות לבדיקה, עם תגי פלואורסצנציה להערכה מהימנה של תרכובות.
- אנליטיקה: מאפשר מעקב מבוסס עוצמה של נקודות Gag וניתוח אוטומטי/ידני להשוואת שיעורי העברה בין תנאים שונים.
- מחקר תרגומי: מקשר לרצף פרה-קליני באמצעות שימוש בתאי T CD4+ ראשוניים ובתנאי דימוג רלוונטיים פיזיולוגית.
- שימוש חוזר ארגוני: מכונן פלטפורמת דימוג לשימוש חוזר למחקרי העברה ויראלית מתא לתא במגוון פתוגנים ותחומי טיפול.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית בהדבקה ב-HIV על ידי אספקת רזולוציה מרחבית-זמנית של תנועת חלבונים ויראליים.
- ערך תפעולי: מבטיח הדירות באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים של טרנספקציה, סימון והכנת תאי בידוד.
- ערך אסטרטגי: משפר קבלת החלטות מסוג go/no-go באמצעות אספקת ראיות ויזואליות ישירות למודולציה של המטרה בהפצה ויראלית.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של תרופות אנטי-ויראליות מותאם סיכון, בהתבסס על עיכוב מוכח של מעבר מתא לתא במודלים רלוונטיים למחלה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בדימוי תאים חיים, וירולוגיה ונהלי בטיחות ביולוגית ברמה 2+/3 לטיפול בתאים המבטאים HIV.
- תלוי במיקרוסקופיה קונפוקלית עם דיסק מסתובב (spinning disc), מצלמת EM-CCD, כיוון לייזר ובקרה סביבתית לדימוי בטמפרטורה של 37°C.
- מצריך סטנדרטיזציה בין-צוותית של תהליכי הכנת תאים, סימון פלואורסצנטי וניתוח תמונות.
- כולל שיקולי התאמה לסוגי תאים שונים או למבנים ויראליים שונים, תוך שמירה על דיוק הוויזואליזציה של הסינפסים.
- מוגבל על ידי סיכוני פוטובליצ'ינג (הלבנה פוטוכימית) ופוטוטוקסיות במהלך דימוי ממושך, אשר מופחתו על ידי שימוש במצלמת EM-CCD בעוצמת אור נמוכה ובסגירת תריס הלייזר.
שאלות נפוצות בביופארמה
Chapters in this video
0:55
Introduction
0:00
Title
1:26
Preparing the Donor (Jurkat) and Target (Primary) CD4+ T cells
3:47
Cleaning Up the Donor Cells and Labeling the Target Cells
12:02
Representative Images of Cell-to-cell Transfer of HIV
12:29
Conclusion
6:36
Monitor Cell-to-cell Transfer of HIV Gag-iGFP Using Live Cell Transfer
