אבי העורקים Assay טבעת

המטרה הכללית של בדיקת טבעת האורטה (aortic ring assay) היא לספק מערכת ניסיונית גמישה שבה כלי דם צומחים מחתיכות שלמות של אורטה של עכבר בתוך מטריצה תלת-ממדית. דבר זה מושג תחילה על ידי נתיחה והוצאה של האורטה החזיית מעכבר, ולאחר מכן ניקוי קפדני של כל רקמה סביבה שנותרה. פרוסות של האורטה הנקייה או טבעות אאורטליות מונחות בתוך בארות בודדות של פלטה בעלת 48 בארות, כאשר כל בארה מכילה תמצית מטריצה בסיסית (BME) המעוצבת ככיפות.

טיפה נוספת של BME עוטפת את הטבעת במבנה תלת-ממדי. המטריצה יכולה להכיל כל ריאגנט ניסויי מתוכנן. לאחר דגירה של מספר ימים, ניתן להבחין בכלי דם המנבטים מטבעות האורטה, ובכך ניתן להעריך את הפוטנציאל האנגיוגני של תרכובות הבדיקה.

שלום, אני קרן ביין מהמעבדה של ד"ר E. Lewis במחלקה לבכימיה קלינית באוניברסיטת Beon of the Negative בבאר שבע, ישראל. היום נדגים לכם פרוטוקול לביצוע בדיקת טבעת אאורטה בעכברים. אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדה שלנו כדי לחקור את ההשפעות של חומרים שונים על היווצרות כלי דם.

אם כן, בואו נתחיל. כדי להתחיל בהליך זה, יש להמיס את תמצית המטריצה של בשראת הבסיס (BME) על קרח או בטמפרטורה של 4 °C. לאחר ההמסה, יש להמשיך לשמור על ה-BME קריר כדי למנוע ממנו להתמצק שוב.

ביום הניסוי, השCח עכבר בן שש עד שבעה שבועות באמצעות הזרקה סטנדרטית של ketamine ו-xylazine, בצע דימום מהיר דרך עורקי הצוואר, ולאחר מכן בצע נתיקה של חוליי הצוואר (cervical dislocation). התחל את ההליך בניגוב בעל החיים ב-70% ethanol תחת מครอบ זרימה למינרית סטרילי. לאחר מכן, בעבודה תחת מיקרוסקופ דיסקציה, השתמש בפינצטה סטרילית ובמספרי דיסקציה כדי לבצע חתך אנכי בעור ולפתוח את דופן הפריטונאום.

יש לבצע חיתוך כדי לחשוף את החלק העליון של גרם הסטרנום (עצם החזה), שם יש לחתוך גם את כלוב הצלעות ולהסיר את הסרעפת. המשיכו לדחוף בזהירות את כל האיברים הצידה כדי לחשוף לחלוטין את אבי העורקים החזי (thoracic aorta) הממוקם לצד עמוד השדרה. לאחר חשיפת אבי העורקים, הכניסו פינצטה סטרילית דקה בין אבי העורקים לבין עמוד השדרה. פתחו את הפינצטה והרימו בהדרגה את אבי העורקים מהמיסתו, תוך הפרדת הקטע החזי משאר אבי העורקים.

כעת, לאחר שהאורטה הופרדה, השתמשו במספריים חדות כדי לחתוך אותה מהעכבר, החל מהקצה הנמצא בקרבה לכלי הדם הכליתיים ועד לאזור הלב. העבירו את האורטה התורקית שהוצאה לכלי פטרי מלא ב-PBS סטרילי קר. כעת, לאחר שהאורטה הוסרה, ניתן להכין טבעות אאורטליות באמצעות שתי פינצטות סטריליות ועבודה תחת מיקרוסקופ בינוקולרי.

נקו את העורק האאורטי החזי (thoracic aorta) מרקמת שומן מסביב. ודאו שאינכם פוגעים באאורטה והחזיקו אותה רק בקצוות. יש לטבול את האאורטה שוב ושוב בתוך כלי הפטרי המכיל PBS כדי למנוע התייבשות עד לסיום תהליך הניקוי.

כעת, לאחר שהאאורטה החזיית נקייה, השתמש בסכין כירורגית ועבוד תחת מיקרוסקופ בינוקולרי כדי לחתוך את האאורטה באופן אחיד לטבעות של מילימטר אחד. השתמש בסרגל המונח מתחת למשטח החיתוך כמדריך, והקפד להשתמש בלהב חד ולהחליפו מעת לעת כדי לשמור על חדותו. קצוות האאורטה אינם בשימוש. לאחר חיתוך כל טבעה, השתמש בפינצטה כדי להעביר אותה בעדינות רבה לכלי חדש המכיל PBS קר.

הניחו את כל הטבעות באותה פלטה המכילה PBS כדי להבטיח שהבדיקה תהיה רנדומלית. מכיוון שלכל מקטע של האורטה יש פוטנציאל אנגיוגני שונה במקצת, שמרו את הטבעות על קרח. לאחר מכן, הכינו את פלטת הבדיקה באמצעות טיפים של פפtoDate מקוררים מראש.

הוסיפו לכל באר בלוח בעל 48 באערים טיפה של כ-150 µL של BME קר; הטיפה מתקשה לצורת כיפה במהלך התנועה. ה-BME מאפשר הובלה של חומרים, כימוטקסיס של תאים, וחשוב מכל,התמיינות תאים ונדידה המובילה ליצירת כלי דם חדשים (neo vessels); את הבאערים ההיקפיים מלאו ב-PBS כדי למנוע התייבשות של ה-BME. אפשרו לטיפת ה-BME להתקשח בטמפרטורה של 37 °C למשך 20 עד 30 דקות. לאחר שה-BME התקשח, הוציאו בזהירות טבעת אבירטית (aortic ring) מתוך פטרי dish באמצעות פינצטה. כדי למנוע נזק, יש להעביר את הטבעת לתוך טיפת השומן שנוצרת בין קצות הפינצטה. כתוצאה ממתח פשטי של הנוזל, הניחו טבעת אבירטית בודדת במרכז החלק העליון של כל כיפה והדגרימו למשך 10 דקות בטמפרטורה של 37 °C. על גבי כל טבעת, הוסיפו 150 µL נוספים של BME והדגרימו למשך 20 עד 30 דקות.

בטמפרטורה של 37 °C, הטבעת עטופה כעת ב-BME ובנוזל הבדיקה. ניתן להוסיף חומרים ללוחית כדי להתחיל את הבדיקה. המלאו מצע ללא סרום לתאי אנדותל אנושיים שהוכן מראש, עם החומר הניסויי או עם תוסף לצמיחת תאי אנדותל כביקורת חיובית או ביקורת שלילית.

השתמשו במצע לבדו. הוסיפו 500 µL של מצע תוסף ה-pres לכל באר והדגירו בטמפרטורה של 37 °C למשך שישה עד 12 ימים. במהלך תקופת הדגירה, בחנו את הפלטה תחת המיקרוסקופ וחפשו כלי דם המנבטים מהאאורטה וכלי דם בשלים מתקדמים המזוהים על ידי התפצלות נוספת של כלי דם.

יש לצלם בתלת-ממד את הטבעות מרקמת הטבעת בין היום השישי ל-12 תחת סטראוסקופ סטנדרטי בניגוד מופע (phase contrast). בנוסף, יש לאסוף תעלילים (supernatants) בימים שונים בין היום השישי ל-12 ולאחסנם בטמפרטורה של 4°C לשימוש תוך יום, או להקפיא ולאחסן בטמפרטורה של 20-°C או 80-°C לשימוש עתידי. ניתן לנתח את התעלילים בטכניקות שונות כגון ELISA עבור vgf או בדיקת Griess לרמות של nitric oxide.

תמונות אלו נאספו 12 ימים לאחר הנחת הטבעות בבארות ודגירה עם תרבית, מצע (הנראה בשורה העליונה של התמונות) או ECGS ששימש כביקורת חיובית לנביטת כלי דם (הנראה בלוח התחתון). כל תמונה היא צילום מייצג של ארבע מתוך 12 הטבעות, שנעשה בהן שימוש בדרך כלל בבדיקה עבור כל תנאי.

הפינה של כל טבעת אאורטה בכל באר נפרדת היא שחורה. כאשר מצלמים באופן זה, טבעות אאורטה שנחשפו ל-ECGS מראות צמיחת כלי דם, והחיצים מצביעים על כמה מהכלים הרבים שהיווצרו. כל כלי דם מאופיין כשרשראות של תאי אנדותל עם התפצלוּת מזדמנת, המעידה על כך שהם בשלים.

לא ניתן להבחין בכלי נביטה בתרבית. בארות המצע בלוח העליון; הרגע הצגנו כיצד לבצע את בדיקת הנביטה של אבי העורקים בעת ביצוע הליך זה. חשוב לזכור לעבוד בדייקנות ותחת תנאיהם.

זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.