בימוי נייד הרכבה עצמית לפברק Cell-נגזר טבעות רקמות לניתוח biomechanical הנדסת רקמות

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא ליצור מבני רקמה תלת-ממדיים מתאיים מצוברים וממטריקס שמקורו בתאים, אשר ניתן להשתמש בהם לצורך ניתוח תפקודי. דבר זה מושג תחילה על ידי עיבוד שבבי של תבנית פוליקרבונט ליצירת בארות טבעתיים בעלות תחתית עגולה. לאחר מכן, שופך poly dimethylsiloxane או PDMS על תבנית הפוליקרבונט כדי ליצור תבנית יצוף.

לאחר מכן, תבנית ה-PDMS משמשת ליצירת בארי aros. השלב הסופי הוא זריעת תאים לתוך בארי ה-aros כדי לאפשר להם להתרכז וליצור טבעות רקמה לכידות. בסופו של דבר, ניתן להשתמש בשיטה זו כדי להשיג הרכבה עצמית תאית והנדסת רקמות באמצעות סוגי תאים שונים, והיא מאפשרת ניתוח של תרומת התאים והמטריצה החוץ-תאית הנגזרת מהם למבנה הרקמה ולתפקודה.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני גישות אחרות להנדסת רקמות הוא היכולת לייצר מבני רקמה המורכבים כולית מתאים ומהמטריצה החוץ-תאית שהם מייצרים במהירות רבה יותר ממה שדווח בעבר, ובפורמט המאפשר ניתוח מכני. התחילו בשיוף של חתיכת פוליקרבונט בעובי של חצי אינץ' כדי ליצור 15 בארות טבעתיות בעלות תחתית עגולה עם קוטר עמוד מרכזי של שני מילימטרים. נקו את תבנית הפוליקרבונט כדי להסיר שאריות פלסטיק שנוצרו בתהליך השיוף והניחו לתבנית להתייבש. לאחר מכן, ערבבו PDMS ביחס של 10 ל-1 של בסיס לחומר המקשה. בצעו דגזציה (ניקוי גזים) לתמיסה כדי להסיר את כל בועות האוויר, ולאחר מכן שפכו אותה לתוך תבנית הפוליקרבונט.

לאחר מכן, בצעו שנית ניקוי גזים (degassing) של התערובת על התבנית כדי להסיר בועות אוויר שנותרו, והקשיחו את ה-PDMS בתנור בטמפרטורה של 60 °C למשך ארבע שעות. בזמן שה-PDMS עובר הקשחה, המיסו 2% AROS ב-DMEM. לאחר ההקשחה, הסירו בזהירות את תבנית ה-PDMS על ידי קילוף איטי מהפוליקרבונט, לאחר מכן שטפו את ה-PDMS בסבון ובמים והעבירו אותו לאוטוקלב יחד עם תמיסת ה-DMEM AROS. כעת, הניחו את תבנית ה-PDMS שעברה עיקור באוטוקלב על משטח מאוזן ומלאו אותה ב-AROS מומס, תחילה על ידי העברת AROS באמצעות פיפט לכל אחת מהתבניות של העמודים המרכזיים, ולאחר מכן על ידי העברת AROS למרחב שסביבם.

המתינו עד שה-aros יתגבשו למשך כ-15 דקות. לאחר מכן, הפכו את התבנית כדי לשחרר את ה-aros מה-PDMS. גזרו את עודפי ה-aros מסביב לכל אחת מהבארות, ואז מקמו בארת aros אחת בכל בארה של פלטת 12 בארות.

הוסיפו מצע גידול תאים מסביב לבאר ה-aros מבלי לכסות את חלקו העליון של הבאר. לאחר מכן, הכניסו את הצלחות לאינקובטור כדי לאפשר להן להגיע לשיווי משקל בעוד התאים מוכנים. כאשר התאים מגיעים ל-90%confluence, בצעו trypsin לתאי שריר חלק מעורק אבירטי של חולדה ו-resus.

שHה תאים בריכוז של 5×10⁶ תאים למיליליטר. לאחר מכן, העבירו בפיפט 100 µL מת сусפנזיית התאים לכל אחת מבארות ה-aros שהגיעו לשיווי משקל. השתמשו בתנועה סיבובית כדי לפרוס את התאים בכל אחת מהבארות.

הניחו את הפלטות באינקובטור למשך 24 שעות ללא הפרעה. החליפו את המצע בכל יומיים על ידי שאיבת המצע מסביב לבאר ולאחר מכן מילוי מחדש של כל באר עד שהתבנית של ה-aros תהיה טבולה לחלוטין. ובסיום התרבית, מלאו צלחת פטרי קטנה ב-PBS.

הוצאו כל טבעת מהתבנית שלה על ידי החלקתה מעל העמוד המרכזי. הניחו את הטבעות בצלחות פטרי עם PBS Center, וטבעת אחת תחת מערכת הדימות הדיגיטלית. השתמשו בתוכנה לזיהוי קצוות כדי למדוד את עובי הטבעת בארבעה מיקומים: למעלה, למטה, משמאל ומימין להיקפה.

לביצוע בדיקת מתיחה חד-צירית. הצמידו דגימת טבעת לשני תפסני חוט דקים. הריחו את התפסנים עד להפעלת עומס קריעה של 5 mN על הטבעת.

לאחר מכן, הזינו את שטח החתך שחושב ממדידות העובי ורשמו את אורך המדידה (gauge length). בצעו שמונה מחזורי טעינה מקדימים (pre-cycle) לטבעת בין עומס הקריעה ל-50 kilo pascal. הפעילו מאמץ בקצב של 10 millimeters per minute; לאחר מחזור הטעינה המקדימה השמיני, משכו עד לכשל בקצב של 10 millimeters per minute.

עבור כל טבעת, מדדו את מאמץ המתיחה הסופי ואת מאמץ הכשל, וחשבו את מודול המשיק המקסימלי מהנתונים שנרכשו. בנוסף למחקרים פונקציונליים in vitro, טבעות תאים חיים אלו יכולות גם להתמזג ליצירת צינורות רקמה. השתמשו במספריים כירורגיים כדי לחתוך את קצות צינורות הסיליקון בזווית ליצירת קצוות אלכסוניים, ולאחר מכן בצעו אוטוקלב לצינורות הסיליקון בזמן שהם עוברים את תהליך האוטוקלב.

מלאו צלחת פטרי במצע, העבירו מחזיקי צינורות סיליקון מותאמים שעברו סטריליזציה למדף בטיחות ביולוגית והניחו אותם בצלחת פטרי ריקה. לאחר מכן, הסירו את הטבעות מבארות ה-aros והניחו אותן בצלחת הפטרי המלאה במצע. הניחו את צינורות הסיליקון באותה צלחת פטרי כדי להרטיב אותם לפני השימוש.

השתמשו בפינצטה כדי להניח את קצהו של צינור סיליקון במרכז הטבעת והחליקו בעדינות את הטבעת על צינור הסיליקון. החליקו את הטבעות עד למגע אחת עם השנייה על ידי דחיפה עדינה שלהן לסירוגין בשני הכיוונים לאורך הצינור. לאחר הרכבת הטבעות, יישרו את צינורות הסיליקון בתוך תומכי הפוליקרבונט והבריגו את שני חלקי התומך זה לזה.

הוסיפו 55 milliliters של מצע לצחנית הפטרי. החליפו את המצע מדי שלושה ימים לאורך תקופת התרבית כדי להסיר את צינורות הרקמה. ראשית, מלאו צחנית פטרי ב-PBS.

לאחר מכן, שחררו את צינורות הסיליקון מהמחזיק מפוליקרבונט והשתמשו בפינצטה כדי להחליק את צינורות הרקמה מהצינור הסיליקוני אל תוך הצלחת. כאשר הפעולה מבוצעת נכון, התאים שוקעים לתחתית בארי הלוליות ומתכווצים תוך 24 שעות מההצבה כדי ליצור טבעת רקמה מסביב לעמוד המרכזי בלוליית ה-Agarro; זהו גרף מייצג של עקומת מאמץ-מעיכה שהתקבלה מבדיקת מתיחה חד-צירית של טבעת רקמה בעובי שני מילימטרים שנוצרה מתאי שריר חלק של חולדה. ערכי חוזק המתיחה הסופי, מודול המתיחה המקסימלי ומעטפת הכשל משמשים לאחר מכן להשוואת התכונות המכניות של דגימות טבעות רקמה שגודלו תחת פרמטרי תרבית שונים.

ניתן לשלוט בתכונות המכניות של טבעות רקמה על ידי שינוי פרמטרי התרבית, כולל מספר התאים להשבה, משך התרבית, מצע התרבית וסוג התאים שבהם נעשה שימוש. בנוסף לתאי שריר חלק של חולדה, תאי שריר חלק ראשוניים של אדם יוצרים טבעות רקמה בעלות חוזק מתיקה דומה.

תאי גזע מזנכימליים אנושיים מצטברים אף הם ליצירת טבעות, אך הם לא היו חזקים מספיק לצורך בדיקה מכנית. המערכת שלנו מאפשרת ייצור של מבני רקמה מהונדסים מתאים תאים בלבד, פשוט על ידי זריעת תאים לתוך בארי הארוס (aros wells) המותאמים שלנו. לאחר עיבוד תבנית הפוליקרבונט הראשונית, אנו יכולים לייצר מספר בלתי מוגבל של תבניות PDMS שניתן להשתמש בהן ליצירת התבניות, כך שאין צורך בציוד נוסף.

המערכת היא רב-גונית בכך שהשתמשנו במספר סוגי תאים שונים במערכת כדי ליצור טבעות רקמה, ולכן מערכת זו עשויה לשמש פוטנציאלית הן ליישומים של הנדסת רקמות והן למחקרים in vitro של תרומת התאים והמטריצה החוץ-תאית למבנה הרקמה ולתפקודה.