שיטה מהירה תפוקה גבוהה עבור Ribonucleoproteins מיפוי (RNPs) על mRNA מראש אדם
2 בדצמבר 2009
בשל האופי החולף של mRNA מראש, זה יכול להיות קשה לבודד ללמוד In vivo. כאן, אנו מציגים רומן במבחנה גישה לחקור אינטראקציות חלבון-RNA באמצעות מאגר סינתטי אוליגו כי אריחים על פני אזורים נבחרים של mRNA מראש.
כדי למפות את אתרי הקשירה של ריבו-נוקלאו-פרוטאינים על pre-mRNAs, התחילו בכיסוי (tiling) של האזור המיועד ב-prem NNA הנבדק בחלונות של 30 נוקליאוטידים, וסנתזו את האוליגואנוקליאוטידים המכסים את האזור על מערך (array). האוליגואנוקליאוטידים מופרדים מהמערך על ידי בישול (boiling off) ומשקעים יחד עם ה-RNP הנבדק. מאגר ההתחלה הכולל מסומן באמצעות SCI 3, והמאגר הקשור מסומן באמצעות SCI 5, ושניהם מוחלים על מערך הזיהוי.
לאחר מכן סורקים את המערך ומשתמשים בתוכנה לחילוץ מאפיינים כדי לפרש את התוצאים. שלום, אני קייט ווטקינס מהמעבדה של ויל פיירבראדר במחלקת MCB באוניברסיטת בראון. היום אראה לכם פרוצדורה מהירה וזולה לקביעת המיקום המדויק של קומפלקס RNA-חלבון על prem RNA במעבדה, תוך סינתזה של prem RNA כמאגר של אוליגונוקליאוטידים חופפים.
ניתן להפריד מאגר זה לשבר קשור ושבר שאינו קשור באמצעות שיקוע חסיון משותף (co immunoprecipitation) ולאחר מכן לנתחו באמצעות מערך זעיר (microarray). למרות שלפרוצדורה זו יישומים רבים, אנו משתמשים בה כדי לחקור גורמי שחבור מרובים ואת תפקידם בשחבור חלופי. אם כן, בואו נתחיל.
כדי להתחיל בהליך זה, השתמשו בדפדפן הגנום uc SC להורדת גנים ספציפיים, נקודות חיבור של שחלוף (splice junctions) או אזורי עניין אחרים מהם תעצבו את מאגר ה-prem A. בחרו את החלונות הרלוונטיים, ולאחר מכן בצעו ריצוף (tiling) חישובי על פניהם באורך קריאה של 30 נוקלאוטידים וחפיפה של 20 נוקלאוטידים, כך שכל אוליגו מוסט ב-10 נוקלאוטידים מהקודם לו. לאחר הגדרת האוליגואים באורך 30 נוקלאוטידים, הוסיפו לכל אחד מהם רצפי פריימר אוניברסליים בשני קצותיו.
שלחו את האוליגו-נוקלאוטידים ל-Agilent להדפסה על מערך מיקרו-נבחר (custom oligonucleotide microarray). עם הגעת המערך, התחילו בהשבת אוליגו-נוקלאוטידי ה-DNA מפני השטח על ידי הנחת זכוכית הכיסוי של המערך בתא היברידיזציה של מערכים וטפטוף עדין של 500 microliters של מים דאיוניים על זכוכית הכיסוי. הניחו את זכוכית המערך כשהפנים כלפי מטה מעל זכוכית הכיסוי, כך שהתוויות על כל זכוכית פונות זו לזו, והקפידו למנוע היווצרות בועות אוויר שעלולות לשבש את תהליך השבת האוליגו-נוקלאוטידים.
סגרו את תא ההיברידיזציה וסובבו אותו למשך לילה בטמפרטורה של 99 °C בתנור היברידיזציה. למחרת, הוציאו בזהירות את המערך מהתא ושאבו את המים, המכילים כעת את האוליגו-נוקלאוטידים ששוחררו מפני השטח של המערך. העבירו את מאגר האוליגו-נוקלאוטידים ששוחררו לפ menutup של 1.5 milliliters ובצעו סוניקציה לשבירת גושים פוטנציאליים בעוצמה של 50% amplitude, שלוש פעמים, בפולסים של שלושה עד חמישה שניות בכל פעם. לאחר מכן, הגבירו את כמות המאגר באמצעות PCR במחזור נמוך, תוך שימוש בפריימרים אוניברסליים עם T promoter המחובר לקצם.
מספר המחזורים הנדרשים עשוי להשתנות בהתאם ליעילות השחזור של האוליגו. יש להימנע מביצוע הגברה יתר, המתבטאת כפס מריחה (smeared band) בג'ל אקרילמיד. לבסוף, השתמש בערכת mega short script מבית Amon כדי לתמלל RNA.
יש להפסיק את תגובת השעתוק על ידי מיצוי הפניל כלורופורם של ה-RNA, ולאחר מכן ביצוע שיקוע אתנול באמצעות סודיום אצטט וכן glyco blue כנשא. יש להמיס מחדש את משקע ה-RNA ב-105 µL של בופר TE. זאת כדי לקבוע במדויק את ריכוז ה-RNA.
השתמש ב-ribo green כדי ליצור עקומת סטנדרט. לאחר מכן, בצע מדידה באמצעות קורא לוחיות פלואורסצנטי. מאגר ה-RNA מוכן כעת לתהליך co immunoprecipitation כדי להתחיל את ה-pull down.
ראשית, הכינו את החרוזים המגנטיים על ידי ערבוב של dyna beads של protein A ו-protein G ביחס של אחד לאחד לנפח סופי של 50 µL לכל תגובה. רכזו את החרוזים בנקודה אחת באמצעות מעמד הפרדה מגנטית כדי להסיר את הנוזל העליון (supernatant). לאחר מכן, שטפו פעמיים בנפח שווה של 1X PBS קר; לאחר השטיפה השנייה.
יש להחזיר למצב של תליה (Resus), להשהות את החרוזיים בנפח שווה של 1X PBS קר ולהוסיף שני ננוגרם של הנוגדן perion. כמות זו עשויה להשתנות בהתאם לנוגדן, ולכן ייתכן שיהיה צורך בניסויים כדי למצוא את התנאים האופטימליים לקישור הנוגדן לחרוזיים. יש להדגיר את התערובת למשך לילה בטמפרטורה של 4°C על פלטפורמה מסתובבת.
בבוקר, הוסף שני מיקרוגרם לתגובה של RNA כולל משמרים שעבר סוניקציה כדי לחסום קישור לא ספציפי, וסובב למשך 30 דקות נוספות בטמפרטורה של 4°C. עם סיום שלב החסימה, השתמש שוב במגש המגנטי כדי להסיר את הנוזל העליון. לאחר מכן, שטוף את החרוזים פעמיים ב-1X PBS קר, והשאר את ה-PBS מהשטיפה השנייה במבחנה; העבר מנות של 50 µL מתערובת החרוזים למבחנות חדשות.
מבחנה אחת עבור כל תגובת co IP. החרוזיים מוכנים כעת ל-co ip. השלב הבא הוא הכנת תערובת המאסטר (master mix) על ידי שילוב מאגר ה-RNA oligo עם תמצית גרעין התא.
כמקור ל-RNP, קחו מנה של 50 µL מהתערובת הראשית (master mix) כהגנה כוללת על הדגימה. ניתן להוסיף פריימרים, שהם גרסאות RNA של הפריימרים האוניברסליים, כדי למנוע קישור של חלבונים לרצף הפריימר או היווצרות מבנה שנידי של ה-RNA. כדי להתחיל את תהליך ה-co immunoprecipitation, הסירו את העילוי ממנות החרו지를 ותלו את החרוזים מחדש ב-120 µL מהתערובת הראשית שנותרה. ערבבו את התגובות בטלטול בטמפרטורה של 4 °C למשך שעה עד שעתיים.
בסיום הדגירה, ניתן להוציא נפח קטן של Eloqua, כולל החרוזים, מכל מבחנה. לבדיקה נוספת של יעילות או סגוליות הקשירה, יש להניח את שארית התגובות על המגנט ולהסיר את העליון. לאחר מכן יש לבצע שטיפה אחת עד שתיים עם cold one XPDS.
ה-RNA הקשור לנוגדן שעל החרו지를 באמצעות ה-RNP הוא דגימת ה-IP. השעו שוב את חרוזי ה-IP ב-50 µL של 1% SDS בבופר 0.1 XTE וחממו את הדגימות ב-65 °C למשך 15 דקות. כדי להשקיע את ה-RNA, הסירו את העלייה, המכילה כעת את ה-RNA שהיה קשור קודם לכן לחרוזים, ונקו אותו באמצעות חילוץ פניל-כלורופורם, ולאחריו שקיעה באתנול; השעו שוב את המשקע ב-50 µL של בופר 0.1 XT.
בשלב הבא, בצעו שעתוק הפוך לדגימות באמצעות הפריימרים האוניברסליים ההפוכים. לאחר מכן, בצעו הגברה באמצעות PCR לדגימות עם הפריימרים האוניברסליים, כאשר אחד מהם צריך להכיל פרומוטור T7. מספר המחזורים הדרושים להגברת המאגר תלוי ביעילות ה-co ip.
בעזרת ערכת הסקריפט mega shorts מבית Ambion, בצעו שעתוק של הדגימות פעם נוספת, אך הפעם הוסיפו שני מיקרוליטרים של amino allele UTP במקום ה-T7 UTP המגיע עם הערכה. ה-amino allele UTP ישמש מאוחר יותר לסימון ה-RNA באמצעות side eyes. עם השלמת השעתוק.
חילוץ פניל כלורופורם ואתנול משקיעים את הדגימות. אין להשתמש ב-glyco blue או באמוניום אצטט, שעלולים להפריע להיברידיזציה של הדגימות למערך. השCה את המשקע ב-4.5 µL של נתרבן קרבונט 0.1 M.
לסימון הדגימות תחילה, הוסף 2.5 µL של מים נקיים מנוקלאז (nuclease free water) לדגימה הכוללת. הוסף שלושה µL של S3, ולדגימת ה-IP הוסף שלושה µL של SCI five. הדגר בחושך למשך שעה אחת.
בטמפרטורת החדר, הפסיקו את התגובה על ידי הוספת 6 µL של hydroxyl lamine HCL בריכוז 4 M לכל דגימה, ערבבו היטב וסובבו בצנטריפוגה. דגרו למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר, טהרו את הדגימות המסומנות באמצעות מיצוי בפניל כלורופורם, ולאחריו שקיעה באתנול. רוב הצבע נסחף אל הפאזה האורגנית יחד עם הנוקלאוטידים החופשיים, לכן ייתכן שהמשקעים לא יהיו צבעוניים באופן גלוי.
שעלקו כל משקע ב-50 µL של 0.1 XTE. פעלו לפי ההוראות של ערכת ההיברידיזציה למערכי Agilent להכנת דגימת המיקרו-מערך, למעט החריג הבא: אין לפרק את ה-RNA. לאחר הוספת תמיסת הפרקטורציה (fragmentation buffer), הוסיפו מיד את תמיס ההיברידיזציה כדי לעצור את תהליך הפירוק.
הנח את הדגימות על המערך ובצע היברידיזציה בטמפרטורה של 50 °C למשך שלוש שעות בעוד המערך מסתובב. הכן את התמיסות הבאות בנפח 50 ml בתוך מבחנות קוניות של 50 ml: מבחנה אחת של 2X SC buffer, שתי מבחנות של 1X SC buffer ומבחנה אחת של מים דה-יוניים.
לאחר דגירה של שלוש שעות, שחררו בזהירות את תבסית המערך (array slide sandwich) והניחו אותה בתוך בופר 2X SSC. באמצעות פינצטה, הפרידו בעדינות את המערך מזכוכית הכיסוי.
הסירו בעדינות את זכוכית המכסה, תוך הקפדה שלא לגעת במערך. בעוד הזכוכית נשלפת, סגרו את המבחנה הקונית והפכו אותה בעדינות למשך 60 שניות. בעזרת פינצטה, העבירו את המערך לתמיסת one XSSC.
סגרו את המבחנה והפכו אותה בעדינות במשך דקה אחת. לאחר מכן, העבירו את המערך לתמיסת XSSC השנייה ושוב, הפכו אותה בעדינות למשך דקה נוספת. לבסוף, העבירו את המערך למבחנה עם מים דה-יוניים והפכו אותה בעדינות למשך 30 שניות.
ייבשו את המערך על ידי הנחת קצוות השקופית על נייר Kim wipe. המשיכו לסובב את המערך על הנייר, תוך הקפדה שלא להפריע לצד המכיל את האוליגונוקלאוטידים. הכניסו את המערך לשפופרת קונית ריקה והמשיכו לסריקת המערך.
המשיכו לסריקת המערך. להלן מערך מייצג. כל מאפיין (feature) או אוליגו צבוע בירוק עבור המאגר הכולל שאינו מועשר, או באדום עבור המאגר המועשר ב-IP.
האות בכל מאפיין מנורמל לעוצמה הכוללת באותו ערוץ. הפלט הסופי הוא יחס הלוגריתם של הערוץ האדום חלקי הערוץ הירוק. בכל מאפיין במערך, הציון הממוצע בכל קואורדינטה גנומית ממופה למיקום הנתון.
איור של שלב ממוצע זה מוצג עבור שלושה אוליגו-נוקלאוטידים חופפים בני 30 נוקלאוטידים עם ציונים של שניים, ארבעה ו-0.5, כאשר ציון העשרה הממוצע עבור כל חלון של 10 נוקלאוטידים מוצג. להלן דוגמה לסכימת קישור עבור החלבון הקישור PTB (poly pyrimidine tract binding protein) בגן CLTA; מאפייני הגן מוצגים לאורך התחתית, וציוני העשרה ממוצעים לוגריתמיים עבור ה-PTP bound S מיוצגים על ידי פסים אנכיים בצבע אדום כהה. פסים באדום בהיר מראים אזורים שאינם מועשרים בקישור PTP.
הראיתי לכם כעת כיצד ליצור במהירות וביעילות מאגר אוליגונוקלאוטידים המכסה (tiles) אזורים של עניין, כגון אקסונים שעברו שחור חלופי. אנו מנתחים את המאגרים שלנו באמצעות מיקרו-מערך (microarray), אך ניתן לרצף אותם גם באמצעות illuminous, Lexi sequencing, או ריצוף סנגר (Sanger sequencing) מסורתי יותר. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור כי יצירת המאגר פתוחה לשינויים, הן ברמת ה-RNA והן ברמת החלבון.
ברמת ה-RNA, ניתן להחדיר אזורים אוטולוגיים, מוטציות של מחלה, פולימורפיזמים או מוטציות אקראיות לרצף האוליגנוקלאוטיד. ברמת החלבון, ניתן לשנות את גורם קישור ה-RNA באמצעות פוספורילציה או מודיפיקציות פוסט-טרנסלציוניות אחרות. כמו כן, ניתן לתמרן את סביבת הקישור כדי להעלות או להפחית רמות של גורמים נוספים המתחרים עם חלבון קישור ה-RNA הנבחר או מקיים איתו אינטראקציה.
זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה מהירה וחסכונית במשאבים למשקוף (mapping) ברזולוציה גבוהה של אתרי קישור של ריבונוקלאו-חלבון (RNP) על pre-mRNA באופן in vitro. באמצעות סינתזה של מאגר מותאם אישית של אוליגנוקלאוטידים חופפים המכסים את האזורים הרלוונטיים, הפרוטוקול מאפשר זיהוי מדויק של אינטראקציות חלבון-RNA, ובכך מתגבר על הטיות המובנות בגישות מסורתיות של co-immunoprecipitation (co-IP) ו-SELEX.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- ביולוגיה של RNA
- ביולוגיה מולקולרית
- שחוץ אלטרנטיבי
רקע
- גישות מסורתיות של co-IP וריצוף מוטות לטובת RNA בשפע גבוה, מה שמגביל את חקרם של מיני pre-mRNA חולפים.
- מיקום ההיקשרות של חלבוני קישור ל-RNA (RBPs) קובע לעיתים קרובות את תפקידם בבקרת השבביה (splicing).
- שיטות קיימות מתקשות במיפוי אינטראקציות RNP על RNA בשפע נמוך או על RNA חולף.
- ניתן לתכנן מאגרי אוליגונוקלאוטידים מותאמים אישית כדי להכווין לאזורי pre-mRNA ספציפיים, דבר המאפשר מחקרים מותאמים.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה לאחيانة, בעלת רזולוציה גבוהה ונטולת הטיות, למיפוי אתרי קישור של RNP על pre-mRNA.
- מתן אפשרות למחקר של גורמים מבניים וגורמים תלוי-רצף המשפיעים על קישור RNP.
- אספקת פלטפורמה גמישה לבחינת השפעות של מוטציות או פולימורפיזמים על אינטראקציות של RNP.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- תכנון וסינתזה של אוליגוניוקלאוטידים חופפים באורך 30 נוקלאוטידים המכסים אזורים נבחרים של pre-mRNA.
- השבה והגברה של אוליגואים ממערך זעיר (microarray) מותאם אישית, ולאחריה תמלול in vitro ל-RNA.
- שיקוע חיסוני משותף (co-IP) של מאגר ה-RNA עם ה-RNP הרלוונטי באמצעות חרוזי מגנט מצומדים לנוגדנים.
- הפרדה של פראקציות RNA קשורות ולא קשורות, סימון פלואורסצנטי והibridiזציה למערך זעיר לזיהוי.
- סריקה וניתוח של נתוני המערך ליצירת מפות קישור ברזולוציה גבוהה.
תוצאות עיקריות
- השיטה מייצרת מפות ברזולוציה גבוהה של אתרי קישור של RNP על pre-mRNA.
- היא מאפשרת זיהוי של מאפיינים רצפיים ומבניים המשפיעים על קישור RNP.
- הגישה מונעת הטיית דגימה כלפי mRNAs שמימם גבוה, כפי שניתן לראות בשיטות IP ו-SELEX מסורתיות.
- גמישות בתכנון מאגר האוליגוז מאפשרת מחקרי מטרה של אזורים ספציפיים, מוטציות או פולימורפיזמים.
מסקנות
- טכניקת המיפוי in vitro זו מספקת כלי רב עוצמה לחקר אינטראקציות RNP של מיני pre-mRNA זמניים או כאלה המצויים בריכוז נמוך.
- השיטה מהירה, זולה וניתנת להתאמה לצרכים ניסויים שונים.
- היא מאפשרת ניתוח רחב היקף של ספציפיות קישור RNP וההשפעה הפונקציונלית של וריאציות ברצף.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמך סיכום
מיפוי אתרי קישור של ריבונוקלאו-פרוטאין (RNP) על pre-mRNA ברזולוציה גבוהה הוא קריטי להפחתת סיכונים באימות מטרות ולהבנת תפקודי גורמי שחבור (splicing factors) בשלבי הגילוי המוקדמים. שיטה מהירה זו, בעלת תפוקה גבוהה ובביצוע in vitro, מאפשרת בחינה בלתי מוטה של אינטראקציות RNA-חלבון, תוך התגברות על הטיות דגימה הנובעות משכיחות החומרים ותמיכה בביטחון ניבוי במחקרי מנגנונים. גישה זו משפרת את קבלת ההחלטות בניהול פורטפוליו על ידי מתן אפשרות לניתוח שיטתי של קובעי מבנה ורצף ספציפיים בקישור RNP.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר מיפוי מדויק של אתרי קישור של RNP כדי להבהיר את מנגנוני גורמי השחזור (splicing factors).
- תומך בתיקוף תפקודי של מטרות על ידי זיהוי גורמים רצפיים ומבניים הקובעים את הקישור.
- מסייע בביטחון חיזוי בבחירת מטרות על ידי הפחתת הטיות דגימה כלפי RNA שכיחים.
- מאפשר בחינה רחבה של השפעת מוטציות או פולימורפיזמים על אינטראקציות של RNP בקנה מידה גדול.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מכין סובסטראטים מאוששים של RNA לצורך סריקה של חלבונים נקשרי-RNA במקומים הבאים.
- מספק נתוני העשרה כמותיים וניתנים לשחזור לצורך סטנדרטיזציה של הבדיקה.
- מאפשר מיפוי רחב-היקף (high-throughput) הניתן להרחבה וניתן להסתגלות לאזורי RNA שונים ולצרכים ניסיוניים מגוונים.
- תומך בהערכה אמינה של השפעות של תרכובות או הפרעות גנטיות על קישור RNP.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתיישב עם אירועי שחבור הרלוונטיים למחלה על ידי מתן אפשרות למיפוי ממוקד של אזורים בעלי משמעות קלינית.
- מספק רציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני באמצעות תמיכה במחקרים פונקציונליים של וריאנטים ברצף.
- מפחית סיכונים בפיתוח ביומרקרים תרגומיים על ידי הבהרה של ספציפיות האינטראקציה של RNP.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
שיטה זו משתלבת ברצף הגילוי, החל ממחקרי מנגנון מוקדמים דרך זיהוי מובילים (leads) ומחקר פרה-קליני, ובכך היא תומכת בתיקוף מטרות מונחה-השערות ובפיתוח בדיקות (assays).
- ביולוגיה של גילוי: מאפשרת בדיקת השערות לגבי ספציפיות קישור של RNP והבהרה של מסלולים ביולוגיים.
- סריקה: מספקת פלטי העשרה כמותיים וניתנים לשחזור לצורך בדיקת מוכנות של המערך.
- אנליטיקה: מייצרת מפות קישור ברזולוציה גבוהה ומדדי העשרה של יחס לוגריתמי (log-ratio) לצורך ניתוח השוואתי.
- מחקר תרגומי: תומכת במיפוי של מוטציות או פולימורפיזמים רלוונטיים למחלה המשפיעים על אינטראקציות RNP.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פלטפורמה גמישה הניתנת להתאמה אישית לשימוש חוזר במטרות ובאזורי RNA מרובים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקרי אינטראקציה בין RNA לחלבון.
- ערך תפעולי: מספק תהליכי מיפוי סטנדרטיים, ניתנים להרחבה וניתנים לשחזור.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של המשך או הפסקה (go/no-go) ויעילות הון על ידי מתן אפשרות להפחתת סיכונים יעילה של מטרות.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכון ובקידום של תוכניות המכוונות ל-RNA.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בתכנון אוליגו-נוקלאוטידים, טיפול במערכים של מיקרו-מערכים (microarrays) וביוכימיה של RNA-חלבון.
- דורש גישה לתשתיות של סינתזת מיקרו-מערכים בהתאמה אישית, סימון פלואורסצנטי וסריקת מערכים.
- דורש סטנדרטיזציה בין-צוותית של תכנון מאגרי אוליגו-נוקלאוטידים ושל צינורות עיבוד נתונים.
- ניתן להתאמה לאזורי RNA שונים, מוטציות ומודיפיקציות של חלבונים בהתאם להתפתחות הצרכים הניסיוניים.
- תלוי באופטימיזציה של הנוגדן ומקור ה-RNP לצורך ספציפיות קישור מוגדרת.
שאלות נפוצות בתחום הביופארמה
Chapters in this video
0:00
Title
0:42
Introduction
1:17
Pool Design and Oligo Recovery
3:53
Co-immunoprecipitation of the Oligo Pool with an RNP of Interest
7:50
Labeling the Samples and Hybridizations to the Microarray
10:50
Mapping RNPs on Pre-mRNAs Representative Results
11:56
Conclusion
