שיטה לבידוד וזיהוי mRNAs, רנ"א ורכיבי חלבון של מכלולי Ribonucleoprotein מתמציות סלולריות באמצעות שבב RIP

מטרת סרטון זה היא להדגים את השיטה לבידוד וזיהוי של RNA ומרכיבי חלבון של קומפלקסים של ריבונוקלאופרוטאין מתוך תמריות תא באמצעות שיטות של immunoprecipitation. שלום, שמי גארט דום ואני סטודנט לתואר מתקדמים במחלקה למיקרוביולוגיה מולקולרית ואימונולוגיה באוניברסיטת מיזורי, תחת הנחייתו של ד"ר אלי סו. הודות להתקדמות בריצוף בתפוקה גבוהה ובניתוח יעיל של מערכי מיקרו-מערכים (microarray), ביטוי גנים גלובלי וניתוחו הפכו לצורה קלה וזמינה של איסוף נתונים במודלים רבים של מחקר ומחלות.

עם זאת, רמות mRNA של הגן המטרה במצב יציב אינן תמיד נמצאות במתאם ישיר עם רמות החלבון במצב יציב. בקרה גנטית פוסט-טרנסקריפציונלית היא הסבר סביר להבדל בין השניים, המונעת על ידי אינטראקציות של חלבונים קושרי RNA.

בקרת פוסט-טרנסקריפציה משפיעה על מיקום, יציבות ותרגום של mRNA על ידי יצירת קומפלקס ריבנוקלאופרוטאין עם mRNA מטרת. זיהוי מטרות mRNA חדשות (Denovo) שאינן ידועות מתוך תמציות תאיים בקומפלקס זה הוא מרכזי להבנת המכניזמים והתפקודים של חלבון קושר RNA והשפעתם הנובעת על תפוקת החלבון. פרוטוקול זה מפרט שיטה המכונה שיקוע חיסוני של ריבופרוטאין, או RIP, המאפשרת זיהוי של mRNA ספציפי המשויך לקומפלקס הריבנוקלאופרוטאין.

לפני תחילת הניסוי, קריטי להכין את כל הריאגנטים, המכלים והכלי המעבדתיים. יש לטפל בכלי זכוכית עם מעכב RNase כדי להבטיח שהם נקיים מ-RNA, כגון RNA ZAP מבית Ambion, ולאחר מכן לשטוף אותם במים שעובדו עם DEPC, ולוודא שכל הריאגנטים מאושרים כנקיים מ-RNA. השלב הראשון של הפרוטוקול הוא בידוד קומפלקס הריבונוקלאופרוטאין מהליזאט התאי; יש לאסוף תאי רקמה הגדלים באופן אקספוננציאלי כדי להפיק בין 2 mg ל-5 mg של חלבון כולל עבור כל דגימה בשימוש, כאשר בדרך כלל שתי צלחות תרבית מסוג P150 מספיקות.

כאן אנו קוצרים את שורות התאים של סרטן השד האנושי MB 2 31 ו-MC seven וחוקרים את האינטראקציות הריבנוקלאואיות של חלבון קושר RNA. חשוב לציין עבור כל חלבון קושר RNA הנחקר, כי יש לבצע אופטימיזציה של מספר התאים הכולל וכמויות החלבון כדי למקסם את האינטראקציות המתאימות בין ה-mRNA המטרה לבין החלבון הקושר RNA. השקיעו את התאים באמצעות סרכוז במהירות של 1000 RPM למשך כ-8 עד 10 דקות בטמפרטורה של 4 °C, ולאחר מכן שטפו שלוש פעמים עם PBS קר מאוד. לאחר השטיפה האחרונה, נקשו בעדינות על תחתית המבחנה והשעיו מחדש את משקע התאים בנפחים שווים של באפר ליזיס פוליסומלי מוכן עם מעכבי RNase ופרוטאז.

מומלץ למדוד את הנפח המדויק של משקוף התאים, לערבב בעדינות באמצעות פיפט כדי לפרק גושים של תאים, ולהדגיר את הליזאט על קרח למשך חמש דקות. סבבו בצנטריפוגה ב-13,000 G למשך 20 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס כדי לנקות את הליזאט משאריות; העבירו מיד את העלייה המנוקה למבחנות מיקרו-צנטריפוגה RNase-free שקוללו מראש, שמרו על קרח ואחסנו בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס.

ניתן לאחסן ליזט זה למשך עד שישה חודשים בטמפרטורה של 80°C- . יש להימנע ממחזורי הקפאה והפשרה חוזרים, שכן אלו עלולים להוביל לדגרדציה של חלבונים ו/או של mRNA. מומלץ לבצע את ה-IP באופן מיידי.

בצעו כימות מהיר של ריכוז החלבון בליזאט באמצעות בדיקת חלבון בשיטת Bradford סטנדרטית. לאחר מכן, נצטרך להכין את החומרים לבידוד החלבון הספציפי המבוקש. ראשית, בצעו הנפחה מוקדמת של החלבון.

השרו חרוזי Sphero למשך לילה בבופר NT two מועשר ב-5% BSA, ואחסנו בטמפרטורה של 4°C. השתמשו בבופר NT two ביחס של 4:1 עם חרוזי PAS. ניתן לאחסן את החרוזים לטווח ארוך למשך מספר חודשים בטמפרטורה של 4°C.

כאשר מוסיפים 0.1% sodium azi לפני השימוש, יש להסיר עודפי בופר NT two כך שיחס החרוזים לבופר הסופי יהיה אחד ለአחד. באמצעות מבחנות מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 milliliter נקיות מ-RNA, הסר 100 microliters של SRO speed slurry והוסף 30 micrograms של נוגדן עבור כל תגובת IP בודדת. לדוגמה, בניסוי שלנו השתמשנו בנוגדן who are, שהוא נוגדן mouse IgG one.

לפיכך, הנוגדן השליטה שלנו הוא גם IgG 1. לאחר מכן, יש להוסיף 100 עד 200 µL של NT buffer 2 לתערובת הנוגדנים והחרו지를. בנוסף, יש להשתמש במקביל בנוגדן בעל איזוטיפ תואם או בסרום נורמלי שלם מאותו מין כבקרת נוגדנים נגד RNA רקע.

הוסיפו את הנוגדן המתאים לתערובת החרוצים והדגירו למשך לילה בתנאי גלגול (tumbling) בטמפרטורה של 4 °C. הכינו את החרוצים המצופים בנוגדן מיד לפני השימוש על ידי שטיפה עם 1 mL של בופר NT 2 קר מאוד (בטמפרטורת קרח) חמש פעמים; שטפו את החרוצים באמצעות סנטריפוגציה ב-13,000 G למשך דקה עד שתיים ב-4 °C. הסירו בזהירות את הנוזל העליון (supernatant) באמצעות פפיטר ידני או שואב (aspirator).

שטיפה זו מסייעת בהסרת נוגדנים שאינם קשורים, כמו גם זיהומי RNAs מתערובת הנוגדנים. לאחר השלמת השטיפה האחרונה, השביה מחדש את החרוצים ב-700 microliters של תמיסת T two קרה מאוד, ולאחר מכן טפל במעכבי RNAs שונים כדי להגן על ה-mRNAs המטרה, כולל 10 microliters של RNAs, out 10 microliters של 100 millimolar DTT ו-15 microliters של EDTA. השלם את הנפח ל-900 microliters באמצעות תמיסת NT two.

בשלב הבא, נבצע שיקוע חיסוני (immunoprecipitation) של הקומפלקס המטרה. אנו ממליצים מאוד להשתמש בשלב של ניקוי מקדמי (pre-clear) כדי להפחית את רעש הרקע בניתוח ה-RNA לאחר הליך ה-RIP; בצעו ניקוי מקדמי עם 15 micrograms של בקרת isotype למשך 30 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. הוסיפו 50 microliters של חרוזי PAS שנפחו מראש שאינם מצופים בנוגדן.

דגרו למשך 30 דקות בטמפרטורה של 4°C תוך סיבוב, ולאחר מכן סבבו בצנטריפוגה ב-10,000 G בטמפרטורה של 4°C. רססו למשקע. שמרו את הנוזל העליון (supernatant) עבור ה-ip.

בשלב הבא, הוסף 100 µL של ליזט מנוקה ומבודל המכיל כ-2 עד 5 mg חלבון לתערובת הנוגדנים שהוכנה. דילול הליזט יסייע בהפחתת הרקע; עטוף את המבחנה ב-Parafilm כדי להבטיח איטום הדוק, ודגירה בטמפרטורה של 4 °C למשך ארבע שעות תוך כדי גלגול. לאחר מכן, שקיע את החרו지를 ב-5,000 ×g למשך חמש דקות ב-4 °C, ושמור את הסופרנאט לניתוח פוטנציאלי על ידי אחסון ב-80 °C-, כפי שתואר בעבר. שטוף את החרוזים חמש פעמים עם 1 mL של בופר TNT2 קר מאוד וביצוע סנטריפוגציה.

לאחר מכן, הסר את הנוזל העליון באמצעות פיפטה ידנית או שואב. ניתן להשתמש בשיטות מחמירות יותר כדי להפחית את הרעש ברקע על ידי תוספת של sodium deoxy coate, urea או SDS לבאפר NT two. שמור את הדגימות על קרח ככל הניתן ועבוד במהירות כדי למזער את הפירוק של ה-mRNA המטרה.

לבסוף, נשתמש בטיפולים ב-DNase וב-proteinase K, ולאחריהם שיקוע RNA, כדי לבודד את ה-RNAs של הריבונוקלאו-פרוטאין. לאחר השטיפה, השהו את החרוצים מחדש ב-100 µL של N NT two buffer בתוספת של 5 µL של RNAs free DNAs one. השאירו את הדגימות בטמפרטורה של 37 °C למשך 5 עד 10 דקות. הוסיפו 1 mL של N NT two buffer וסובבו ב-5,000 ×g למשך חמש דקות.

השליכו את ה-SUPERNAT. סובבו את תרחיף החלבון כדי להוביל להיווצרות משקע SROs, והוסיפו 100 µL של תמיסת NT two buffer עם 5 µL של proteinase K בריכוז 10 mg/mL ו-1 µL של 10% SDS. דגרו את תערובת החרו지를 שהושחתה למשך 30 דקות במקלח מים בטמפרטורה של 55 °C, תוך נקישה עדינה מדי 10 דקות. Proteinase K יסייע בשחרור רכיבי הריבנוקלאופרוטאין. צנטריפוגו להשקת החרוזים.

צנטריפוגה במהירות 5,000 G למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר, ואסוף את הנוזל העליון (supernatant), שנפחו אמור להיות כ-100 µl. לאחר מכן, הוסף לטיפות 200 µl של באפר NT 2 וצנטריפוגה ב-5,000 G למשך שתי דקות. אסוף כ-200 µl מהנוזל העליון והשלך את הטיפות.

שלבו את הנוזל העליון (supernatant) והוסיפו 300 microliters של חומצה פנולית לשכבה התחתונה, ערבבו ב-vortex. המתינו דקה אחת בטמפרטורת החדר וסובבו בצנטריפוגה במהירות מקסימלית בטמפרטורת החדר למשך דקה אחת. אספו 250 microliters מהשכבה העליונה.

יש להיזהר מאוד לא להפריע לממשק כדי למנוע זיהום. לדגימת ה-RNA, הוסף 25 µL של sodium acetate ב-pH של 5.2, כ-625 µL של 100% ethanol מקורר ו-5 µL של glyco blue mix. ערבב היטב ואחסן למשך לילה בטמפרטורה של 20- °C.

בנוסף, על מנת להבטיח השבה תקינה של ה-RNA, הוספת GlycoBlue תגביר את הנראות של משקע ה-RNA על ידי תפקוד כמולקולת נשא. למחרת, ערבבו את המבחנות על ידי הפיכה של שלוש עד חמש פעמים, ולאחר מכן סובבו בנצורה ב-12,000 G בטמפרטורה של 4 °C למשך 30 דקות והסילו את הנוזל העליון (supernatant). הוסיפו 1 mL של אתנול 70% מקורר למשקע הכחול וערבבו על ידי הפיכה או וורטקס, ולאחר מכן סובבו בנצורה.

סבב את הדגימה ב-12,000 G בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך שתי דקות. השלף את הסופרנטנט וסבב שנית ב-12,000 G למשך דקה אחת בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. הסר שאריות של 70% ethanol באמצעות פיפט וייבש את המשקע באוויר.

השאירו בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. המיסו מחדש ב-20 עד 40 µL של מים נקיים מ-RNA ו-DNA. הדגימה מוכנה כעת לכימות באמצעות ספקטרומטריית NanoDrop ו ליישומים המשכיים כגון qPCR או אנליזת מיקרו-מערך (microarray). לאחר בידוד ה-RNA, בוצעו אנליזת מיקרו-מערך ו-qPCR כדי לחשוף את מטרות ה-mRNA של החלבון הקושר RNA, וכן את ההעשרה שהתקבלה מה-immunoprecipitation.

אישור באמצעות western blot חושף בידוד נקי של חלבוני ribonucleoprotein. qPCR כמותי מדגים את פי ההעשרה של mRNA של beta actin בהשוואה לבקרי IgG. בעוד שניתוח microarray חושף פרופילים גנטיים ייחודיים בין תאי MCF-7 לבין תאי MDA-MB-231, שניהם שורות תאים של סרטן השד, immunoprecipitation של ribonucleoprotein הוכח על ידי הקבוצה שלנו, כמו גם על ידי קבוצות מחקר רבות אחרות, ככלי מצוין המשמש לבידוד ובחינת האינטראקציות בין חלבונים נקשרי RNA לבין מטרות ה-mRNA שלהם. למרות הרגישות של הפרוצדורה בטבעה ובביצועה, ביצוע נכון של הליך זה יביא לבידוד של קומפלקסי ribonucleoprotein אלו, אשר עד לא מזמן לא היו נגישים לגילוי ולניתוח.