Multi-פרמטרית Perifusion איילט מערכת בתוך התקן Perifusion Microfluidic

במצגת זו, נציג מערכת פרפוזיה לערמומיות המבוססת על מיקרופלואידיקה למדידה סימולטנית של הפרשת אינסולין דינמית, זרימת סידן ושינויים בפוטנציאל המיטוכונדריאלי של אירי לבלב בתגובה למעוררי הפרשת אינסולין. מערכת הפרפוזיה מורכבת מהתקן מיקרופלואידי בעל שלוש שכבות, משאבות מזרק ואספן פראקציות. זרימת סידן ופוטנציאלים מיטוכונדריאליים המושרים על ידי מעוררי הפרשת אינסולין מדומיינים באמצעות מערך מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

שלום, שמי אולה, וולר מהמעבדה של ד"ר Val Holter במחלקה לכירורגיית השתלות באוניברסיטת אילינוי בשיקגו. שלום, אני דון לי, גם מהמעבדה של ד"ר Holter. שלום, אני טרישיה הארט, גם מהמעבדה של ד"ר Holter.

היום נראה לכם פרוצדורה לדימוג בו-זמני של העפעפיים באמצעות מדרג גלוקוז ליניארי. השתמשנו בפרוצדורה זו במעבדה שלנו כדי לחקור את המראה והתפקוד של העפעפיים. אז בואו נתחיל.

ההתקן המיקרופלואידי המשמש להליך זה מורכב משלוש שכבות של PDMS מאובהן שנוצרו באמצעות פוטוליתוגרפיה סטנדרטית. השכבה הראשונה, שנוצרה מתבנית סיליקון, מכילה את בארות ההתקן המיקרופלואידי שיחזיקו בעדינות את הלולאות במקומן, בעומק של 150 micrometers ובקוטר של 500 micrometers. השכבה השנייה כוללת תעלות בגובה 500 micrometers וברוחב שני מילימטרים.

מרכז התעלה מורחב כדי לפרוס את הזרימה לצורך חילוף תמיסה טוב יותר. בתוך המכשיר, באר החילוף נוצרת על ידי ניקוב חור בגובה של 3 mm וברוחב של 7 mm במרכז השכבה. השכבה השלישית היא לוח עבה של PDMS. כדי להכין שכבה זו, נקבו חורים קטנים בשני הצדדים המיושרים עם הכניסה והיציאה של התעלה.

בשכבה השנייה, לאחר שכל שלוש השכבות הוכנו, השכבה הראשונה מודבקת ללבידה של זכוכית כאשר הבארות פונות כלפי מעלה. לאחר מכן, השכבה השנייה מודבקת לשכבה הראשונה כאשר המרווחים של התעלות פונים כלפי מעלה. לבסוף, השכבה השלישית מודבקת לשכבה השנייה.

לאחר שהשכבות הוחברו, המכשיר מוכן לשימוש בניסויים. השתמש במזרק של 10 milliliter מלא ב-70% ethanol ומחובר לפתח הכניסה של המכשיר באמצעות צינור Tygon, ועקר את המכשיר המיקרופלואידי על ידי הזרמת ה-ethanol דרך תעלות המכשיר. לאחר מכן, באמצעות אותה מערכת, הזרם מים דה-יוניזים (deionized water) כדי לשטוף את ה-ethanol.

לאחר עיקור המכשיר, הניחו אותו על במה של מיקרוסקופ מחוממת באמצעות צינורות tigon, וחברו את משאבות המזרקים המכילות תמיסות גלוקוז בריכוז גבוה ונמוך למחבר Y. לאחר מכן, חברו אותן לכניסה של המכשיר המיקרופלואידי. חברו את היציאה של המכשיר המיקרופלואידי לאספן פראקציות.

וודאו שהצינורית מונחת על פלטה מחממת בטמפרטורה של 37 °C. חשוב מאוד לשמור על התמיסות בטמפרטורה פיזיולוגית לאורך כל הניסוי. לאחר מכן, השתמשו בתוכנת LabVIEW כדי להתחיל את מפל הגלוקוז שיזרום דרך הרשת המיקרופלואידית במהלך הניסוי.

תוכנה זו משנה את קצב הזרימה של שני תמיסות גלוקוז. על ידי בקרת משאבות המזרקים, ניתן ליצור כאן פרופילים שונים של מדרג גלוקוז: פרופילי מדרג גלוקוז ליניאריים, בצורת פעמון ובצורת ריבוע. בניסוי זה מוצגים ערכים צפויים מחושבים להשוואה; עבור המדרג הליניארי של 2 millimolar עד 25 millimolar גלוקוז, יעשה שימוש בקצב זרימה משתנה של 0.01 milliliters per minute של שתי תמיסות הגלוקוז ובקצב זרימה קבוע של 0.25 milliliters per minute הנכנס למכשיר לאחר ערבוב התמיסות.

לאחר בחירת פרופיל הגרדיאנט המתאים, יש לבדוק את יציבות הגרדיאנט. ראשית, הפעל את מערכת הגרדיאנט. לאחר מכן, הפעל את אסוף הפראקציות ואסוף שמונה פראקציות בנפח של 1 mL למבחנות Eppendorf.

לאחר מכן, בעזרת גלו可ומטר, בדוק את ריכוז הגלוקוז בכל מבחנה והזן את הנתונים ב-excel. נתח את התוצאות שהתקבלו מהגלו可ומטר. לאחר מכן, החלף את מזרק הגלוקוז בריכוז גבוה במזרק המכיל תמיסת 0.5%BSA בבופר Krebs ringer, ובצע פרפוזיה של 50 milliliters דרך המכשיר בקצב של one milliliter per minute.

פעולה זו תמנע ספיגה לא ספציפית של אינסולין לדפנות המיקרו-ערוץ, כדי להבטיח דיוק בעת מדידה מאוחרת של רמות אינסולין מופרש לאחר פרפוזיה עם BSA. החליפו אותו בתמיסת גלוקוז בריכוז גבוה. השעו 25 עד 30 פסקאות עיניים של עכברים שנבחרו ידנית בבופר קרבס-רינגר עם 2 mM גלוקוז, המכיל את צבע מדד הסידן fira 2:00 AM ואת צבע מדד הפוטנציאל המיטוכונדריאלי rumine 1 2 3, דגרו למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 °C.

לאחר הדגירה, נתק את המכשיר ממערכת הפרפוזיה והכנס בזהירות את האיליטים למכשיר המיקרופלואידי על ידי הכנסת קצה הפ pipette, המכילה את האיליטים, אל פתח הכניסה, ופיזור איטי של האיליטים. לאחר ההטענה, חבר מחדש את המכשיר למערכת הפרפוזיה, תוך הקפדה שלא להחדיר בועות אוויר. לאחר מכן, הפעל את משאבת המזרק כדי להתחיל בביצוע פרפוזיה לאיליטים באמצעות KRB המכיל 2 mM גלוקוז.

שלב זה ישטוף את עודפי הצבע מהתווך, יגדיר את סטים של מסנני העירור והפליטה ואת זמני החשיפה שבהם ייעשה שימוש במהלך הניסוי. לאחר מכן, הגדירו את אספן הפרקציות לאסוף במרווחים של דקה אחת בזמן השטיפה של הלולאות עם תמיסת הגלוקוז בריכוז נמוך. השתמשו בכלי ה-region of interest או בכלי ה-ROI מתוך תוכנת הדימוי הפשוטה של ה-PCI כדי להגדיר את האזורים או הלולאות שברצונכם לדגום.

בנוסף, סמנו במעגל את אזור הרקע שיוחסו לאחר שטיפת התאים למשך 10 דקות, הפעילו את אספן הפרקציות של מדרג הגלוקוז והתחילו בצילום time-lapse. לאחר 30 דקות, כבו את התוכנה ואת משאבת המזרק של גלוקוז בריכוז גבוה. המשיכו בביצוע פרפוזיה עם גלוקוז בריכוז נמוך כדי לשטוף את השפעת הגלוקוז בריכוז הגבוה.

לאחר 10 דקות, הפסק את זרימת הגלוקוז בריכוז נמוך על ידי כיבוי משאבת המזרק. לאחר הפרפוזיה, ייצא את הנתונים לקובץ excel לצורך ניתוח. ניתן לקבוע את כמות האינסולין שהופרשה לתוך הפרפוסאט באמצעות ELA mouse eyelets.

בוצעו פרפוזיה עם גרדיאנט ליניארי של 2 עד 25 מילימול גלוקוז כפי שמוצג כאן. זרימת סידום להפנים והפרשת אינסולין מופעלות לאחר כ-13 דקות של פרפוזיה, המתאימות לריכוז של 6 מילימול גלוקוז. שינויים בפוטנציאל המיטוכונדרי얼 נצפים מוקדם יותר, כצפוי, לאחר כ-11 דקות.

נתונים אלו מדגימים את היתרון שבשימוש ברשת מיקרופלואידית זו לאפיון הפיזיולוגיה של ה-eyelet. הרגשנו להראות לכם כיצד להשתמש במכשיר ה-para fusion המיקרופלואידי שלנו למחקר של פיזיולוגיית eyelet. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לוודא שאין בועות במכשיר, שכן אלה עלולות לגרום לתזוזת ה-eyelets במהלך הניסוי.

בנוסף, ניתן לכוון את הזרימה עד ל-1 ml לדקה מבלי להפריע לטבעות הקיבוע. זהו, תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוי שלכם.