פורסים גירוי המוח באמצעות רשת Microfluidic ולשכת זלוף רגילה

המטרה העיקרית של הפרויקט שנגלה לכם היום היא היכולת לשלוט באופן מרחבי וזמני בגירוי של המוח. נקודה מרכזית נוספת היא שבאמצעות שינוי פשוט במערך האלקטרופיזיולוגי המסובך ממילא, נוכל להפיץ את ההתקן המיקרופלואידי הזה בין המעבדות השונות המשתמשות בפועל בגירוי מוח זה. שלום, אני Java Chek Mohammad ממעבדת Edington במחלקה לביוהנדסינג באוניברסיטת אילינוי בשיקגו.

היום אראה לכם כיצד נשתמש בהתקן מיקרופלואידי פשוט מיוצר במיקרו-פבריקציה לצורך גרייה של פרוסות מוח. התקן פרוסות המוח שנדגים היום שימושי מאוד מכמה סיבות, והסיבות העיקריות הן היותו מודולרי עד כדי כך שהוא יכול להשתלב במערך אלקטרופיזיולוגי קיים ללא צורך בשינויים נוספים. כמו כן, הוא מונע את השימוש בצינוריות ובמשאבות, דבר המסבך כל התקן מיקרופלואידי.

ומכיוון שאנו משתמשים בשיטת שאיבה פסיבית, אין לנו צורך בצינוריות או במשאבות. והדבר השלישי הוא שמדובר פשוט ביריעה דקה של ממбраנת PDMS שמונחת בין זכוכית כיסוי לבין תא פרפוזיה סטנדרטי, המשמש בהקמה סטנדרטית של אלקטרופיזיולוגיה. הפרוצדורה שאדגים היום מתחילה עם תבנית מאסטר של SU8, המיוצרת באמצעות תהליך סטנדרטי של ליתוגרפיית SU8.

התבנית הראשית (master) שיש לנו כאן היום היא תבנית דו-שכבתית, כאשר שכבה אחת כוללת את תכנון התעלות, המיקרו-תעלות, ותכנון נוסף עבור פתחי ה-VR הנמצאים מעל תעלות אלו, כך שהתמיסות הזורמות בתעלות יוכלו לצאת דרך פתחי המעברים (via openings). לכן אנו מכינים את התבנית הראשית הזו, הנמצאת על פרוסת סיליקון, ולאחר מכן אנו משתמשים בסיליקון או ב-PDMS כדי למזוג אותו על גבי ההתקן ולעצב את המבנים הנמצאים על פרוסת הסיליקון בתוך ה-PDMS. לפיכך, אנו עומדים למזוג את ה-PDMS על גבי התקן זה.

כעת ניקח את ממברנת ה-PDMS שנוצרה לאחר הההקשיה וחוברה ללוחית כיסוי. כך נקבל את המכשיר המיקרופלואידי שלנו. לאחר מכן, נבצע שינוי בתא פרפוזיה סטנדרטי על ידי ציפוי שכבה דקה של PDMS בתחתית תא הפרפוזיה.

ברגע שתהיה בידינו תא פרפוזיה משונה זה, ניקח את ההתקן המיקרופלואידי שייצרנו קודם לכן ונצמידו אותו לתא הפרפוזיה. ישנן שתי נקודות קריטיות בייצור ההתקן המיקרופלואידי. הראשונה היא שלפני הנחת ה-PDMS, יש לכבות את הפלטה החמה כדי שה-PDMS לא יקשח באופן מיידי בעת מזיגתו על פרוסת הסיליקון (wafer).

נקודה קריטית נוספת היא שהספייסרים ( spacers) שבהם אנו משתמשים בארבעת הפינות של פרוסת הסיליקון צריכים להיות בגובה נמוך מהמבנה הגבוה ביותר על פרוסת הסיליקון. זאת כדי להבטיח שניתן יהיה להשיג את פתחי ה-VR בעת ביצוע תהליך ההקשחה של ה-PDMS. כעת אנו נמצאים בחדר הנקי המודולרי בעל הדפנות הרכות, וזהו המאסטר שהכנו באמצעות תהליך ליתוגרפיה סטנדרטי של C8.

מדובר במאסטר בעל שתי רמות, כאשר הרמה הראשונה כוללת את התכנון של התעלות עם ארבעה פתחי כניסה ופתח יציאה אחד. באזור המרכזי של כל אחת מארבע התעלות, קיימים vias או עמודים (posts) הניצבים מעל התעלות. אלו הם סימני היישור שנוצרו במהלך תהליך הייצור.

כעת אראה לכם כיצד אסיר אותו ואבצע את פולימריזציית ה-PDMS. בשל אפקט ה-edge bead, העובי בהיקף החיצוני של הפרוסה (wafer) גדול מהעובי של ההתקנים בפועל במרכז הפרוסה. לכן, מה שנעשה הוא להסיר סימני יישור אלו באמצעות להב רזרואר (reservoir blade), ולאחר מכן, כדי להתאים את המשקולות, נשתמש במרווחים אלו שגובהם 140 micron ונניח אותם בארבעת פינות הפרוסה.

לכן עליכם לוודא שלהב התערה לא מגיע קרוב להתקנים עצמם. כעת אסיר את חלקיקי ה-SVA באמצעות מנשף אוויר, והוופר מוכן כעת להכנת תבנית ה-PDMS. אך לפני כן, עלינו להניח את המרווחים, שגובהם 140 micron.

כעת אני אמקם את ארבעת הסרטים בארבעת הפינות של הפרוסה (wafer). לאחר מכן אוודא שהסרט נצמד לפרוסה כראוי. הסיבה לכך שהסרט הוא בגובה 140 micron היא שהמאסטר הדו-שכבתי עם התעלות וה-VS הוא בגובה 150 micron.

כאשר אנו מניחים את המשקולת מעל ה-PDMS במהלך תהליך הפולימריזציה (curing), אנו רוצים לוודא שגיליון ה-PDMS ייצא שטוח. לכן, אנו משתמשים בארבעה מחשפי מרחק (spacers) בגבהים שווים בפינות. כעת אראה כיצד נכין את ה-PDMS ונבצע את הפולימריזציה כדי ליצור את המכשירים.

אך לפני כן, הרשו לי להראות לכם כיצד הכנו את תמיסת ה-PDMS. אנו לוקחים 10 חלקים של הבסיס וחלק אחד של חומר ההקשיה ומערבבים אותם היטב. כפי שניתן לראות, תהליך הערבוב יוצר בועות רבות בתמיסת ה-PDMS; כדי להסיר בועות אלו, נניח את ה-PDMS במייבש (desiccator). לאחר השארת ה-PDMS במייבש למשך 10 דקות, הבועות נעלמות.

כעת ה-PDMS מוכן לשימוש עבור תהליך הפולימריזציה. כעת אראה לכם כיצד נניח את ה-PDMS על גבי הוופר ונבצע פולימריזציה כדי לקבל את ממברנת ה-PDMS. לכן, אני אשים את ה-PDMS על הוופר ולאחר מכן אשתמש בשקיפות זו כדי לכסות את ה-PDMS.

וזה יעזור לנו להסיר את תמיכת המכשיר, להפריד את המכשיר מהשקיפות, ולאחר מכן אני אניח את המשקולות מעל השקיפות. הסיבה לכך שאנו משתמשים במשקולות היא כדי להשיג עובי אחיד של ה-PDMS. נושא קריטי נוסף הוא השגת פתחי ה-via.

לכן, בכל מקום שבו ישנם חללים (vs), אנו רוצים שלא יהיה PDMS והמשקולות יעזרו לנו להשיג זאת. כפי שניתן לראות כאן, פלטת החימום כבויה, והסיבה לכך היא שאיננו רוצים שה-PDMS יתקשה באופן מיידי, ולכן נשאיר אותה כבויה. לאחר מכן, עליכם לוודא שהפרוסה (wafer) שטוחה לפני שאתם שופכים את ה-PDMS.

כעת ניתן להעביר את ה-PDMS שהכנו קודם לכן. ודאו שאתם ממזגים את ה-PDMS קרוב מספיק לווייפר (wafer) כדי למנוע היווצרות בועות. והנקודה הקריטית ביותר כאן היא האופן שבו מניחים את השקיפות מעל ה-PDMS.

עליכם לוודא שלא נוצרים בועות בעקבות הנחת היריעה. כעת אני ממקם את אחת מלוחיות הזכוכית הללו כדי לאפשר לעודפי ה-PDMS לצאת. אני ממקם שלוש לוחיות זכוכית נוספות כדי להבטיח שהלוחיות לא יזוזו עבור התבנית הראשית הספציפית הזו.

עבור מאפיינים ספציפיים אלו, מצאנו שמיקום ארבעת תומכי הזכוכית הללו מאפשר ל-PDMS העודף לצאת מהדרך בין השקיפות לבין הפרוסה. נמתין דקה עד שתי דקות ולאחר מכן נוכל להפעיל את הפלטה החמה. עבור תבניות שונות ועיצובים שונים, ייתכן שתצטרכו להגדיל או להפחית את מספר תומכי הזכוכית כדי לקבל את פתחי המעברים (via openings). כעת הפלטה החמה מוכנה להפעלה, ואני אגדיר טמפרטורה של 75 °C.

ברגע שהטמפרטורה מגיעה ל-75 מעלות, ניתן להפעיל את הטיימר לשעה אחת ולהמתין להתמצקות (curing) של ה-PDMS. כעת, לאחר שהשארנו את ה-PDMS להתמצק במשך שעה, ניתן לכבות את הפלטה החמה ולהמתין שיתקרר עד ל-50 °C. הסיבה לכך היא כדי למנוע סדקים ב-SEA.

אם נסיר את הדגימה באופן מיידי מ-75 מעלות לטמפרטורת החדר, נוכל כעת לכבות את המכשיר ולהמתין עד שהיא תרד ל-50 מעלות צלזיוס. כעת, לאחר שטמפרטורת הפלטה החימה ירדה ל-50 מעלות צלזיוס, נוכל להסיר את המשקולות מהשקיפות. כעת ניתן להסיר את הפרוסה מהפלטה החימה והיא מוכנה לחיתוך.

כעת גיליון ה-PDMS מוכן להסרה מה-C eight master ועלינו להסיר את נייר האלומיניום. לאחר מכן עלינו להסיר את גיליון השקיפות. כאן לפנינו תא פרפוזיה סטנדרטי.

ביצענו בו שינויים כדי שנוכל ליישר אותו. החורים, פתחי הכניסה והיציאה של ההתקן המיקרופלואידי. אלו הם ארבעת פתחי הכניסה ופתח יציאה אחד על ממבקרת ה-PDMS.

אלו צריכים להתאים לארבעת פתחי הכניסה ולפתח היציאה האחד בתא הפרפוזיה. כעת אני מחליק את תא הפרפוזיה ולאחר מכן מיישר אותו עם החורים בממברנת ה-PDMS. כעת, כשהם מיושרים, ניתן לגזור אותם.

כעת ניתן להוציא את התא באמצעות פרוב. ודאו שכל קצוות ממברנת ה-PDMS חופשיים להסרה. לאחר מכן, ניתן להשתמש במקפיא כדי להסיר את ממברנת ה-PDMS; ודאו שבעת הסרת ה-PDMS מחלקו העליון של המכשיר, אתם מזיזים את ה-PDMS לאט מאוד כדי לא לקרוע את ממברנת ה-PDMS.

כעת אני מקם את ממברנת ה-PDMS, שחלוליה נוצרו באמצעות תבניות ה-SC eight, בחלק העליון ומוודא שהיא שטוחה. הסיבה לכך היא שכאשר ניצור את החורים, פתחי הכניסה והיציאה, ה-PDMS לא יהיה מחוספס בצד שיוצמד לכיסוי הזכוכית (cover slip).

לכן עלינו לוודא שהחללים נמצאים בצד העליון. כעת נוכל ליצור את פתחי הכניסה והיציאה כדי שנוכל לראות את החורים בבירור. נניח רקע שחור.

כעת אכין את פתחי הכניסה והיציאה; יש לוודא שלא נותר PDMS בפתח. לכן, אנו מסירים כל שארית של PDMS. כעת נעביר את ממברנת ה-PDMS לדף שקיפות אחר.

כעת נוכל לטפל ביריעה ובזכוכית המכסה באמצעות פלזמה ולהניח אותן כך שהחללים יישארו שוב בחלק העליון. לאחר שפני השטח הללו טופלו בפלזמה והזכוכית המכסה טופלה בפלזמה, נוכל להצמיד את שני המשטחים הללו כדי ליצור את הרשת המיקרופלואידית ולהסיר בועות אוויר שבין יריעות ה-PDMS. לצורך השקיפות ניתן להשתמש בסרט דביק.

פעולה זו תבטיח שדף ה-PDMS יהיה שטוח ושההדבקה תתרחש בצורה טובה הרבה יותר. לאחר מכן, השתמשו שוב בסרט דביק (scotch tape) על פני השטח העליונים כדי להסיר אבק מ membranet ה-PDMS. כעת ניתן להניח את זכוכית הכיסוי (cover slip) שנדביק לממברנת ה-PDMS.

כעת שני רכיבי ה-PDMS והזכוכית מוכנים לטיפול בפלזמה. אנו נבצע טיפול בפלזמה ב-PDMS ובכיסוי הזכוכית (cover slip) באמצעות מערכת פלזמה זו המבוססת על מיקרוגל, שבה ניתן לראות כי תא הזכוכית מאפשר לנו ליצור פלזמה בתוך המיקרוגל. כעת אני מניח את הדגימות בפנים ויוצר ואקום בתוך התא.

כעת אני יכול להזרים חמצן. כעת מערכת הפלזמה מוכנה לפעולה, ואני אשתמש ב-10% power וב-10 seconds עבור מערכת ספציפית זו כדי לסייע בהדמיית הפלזמה. בזמן שטיפול הפלזמה נמשך, העלינו את ה-power למאה אחוזים וכיבינו את האורות.

כעת ניתן לראות את הפלזמה מיד לאחר טיפול הפלזמה. עליך להדביק את שני המשטחים, את זכוכית המכסה (cover slip) ואת ה-PDMS, אחרת משטח ה-PDMS יאבד את ההידרופיליות שלו עקב טיפול הפלזמה. לאחר הנחת זכוכית המכסה, ודא שכל המשטח מודבק יחד ללא בועות אוויר.

אם קיימות בועות אוויר, ניתן להסיר אותן. כעת יש להניח את התכשיר בצד למשך חמש דקות כדי לאפשר את ההדבקה. כאן אנו רואים את תא הפרפוזיה המותאם, שבו שינינו את בסיס התא באמצעות PDMS.

פעולה זו בוצעה בשלב מוקדם יותר. הנחנו דף שקיפות על פלטה חימום שהייתה כבויה, ולאחר מכן יצקנו עליה את ה-PDMS שהוכן באופן דומה לכפי שהודגם קודם לכן.

לאחר מכן הנחנו את תא הפרפוזיה על גבי ה-PDMS, הנחנו משקולת בודדת כפי שמוצג כאן והשארנו את הדגימה להתקשות למשך 30 דקות בטמפרטורה של 75 °C. כעת, בזמן שאנו ממתינים להדבקה של ה-PDMS ושל זכוכית הכיסוי, אראה כיצד ניתן להכין את התא, כך שנוכל לחבר בין התא לבין ההתקן המיקרופלואידי.

לפיכך, עלינו להסיר עודפי PDMS מכל מקום שבו אינם נחוצים. הסר את השקיפות ולאחר מכן את ה-PDMS, ולאחר מכן יש להסיר את ה-PDMS מפתחי הכניסה והיציאה. כעת התא מוכן להדבקה למכשיר המיקרופלואידי שהכנו קודם לכן.

כעת, לאחר שהמתננו חמש דקות, ההתקן המיקרופלואידי מוכן להפרדה מהשקיפות, אך עליכם לוודא שאתם מסירים את השקיפות בקצב איטי. זאת כדי ששכבת ה-PDMS וזכוכית הכיסוי לא יופרדו זו מזו. כעת, כאשר תא הפרפוזיה מוכן, עלינו לבצע טיפול בפלסמה למשטח התחתון של התא שבו ציפינו את ה-PDMS, ולמשטח העליון של ההתקן המיקרופלואידי עליו נמצא ה-PDMS.

כעת נכניס את שני החלקים הללו לתא הפלזמה ונבצע טיפול בפלזמה בהספק של 10% למשך 10 שניות. כעת שני השטחים טופלו בפלזמה והם מוכנים להדבקה. לפני ההדבקה, עליכם לוודא שפתחי הכניסה והיציאה בתא מיושרים עם התקן המיקרופלואידי.

ומכיוון שהמאפיינים שאנו מיישרים גדולים מספיק, איננו זקוקים לציוד מיוחד וניתן לבצע זאת בעין בלתי מזוינת. לאחר היישור וההנחה מעל התא, ודאו שכל המשטחים נמצאים במגע, ולאחר מכן ניתן להמתין חמש דקות. לאחר המתנה של חמש דקות, ההדבקה תהיה מספיק טובה עבור הניסויים.

כעת, לאחר שההתקן המיקרופלואידי הוצמד לתא, נהפוך את פני השטח של התעלות להידרופיליות. כך, כאשר נזרימ בפועל תמיסת A CFS או מוליכים עצביים אחרים, התמיסות יוכלו לזרום בקלות רבה יותר. לכן, אני אכניס את ההתקן כולו למכשיר הפלזמה ואבצע טיפול בפלזמה למשך דקה אחת ב-10%, כך שכל פני השטח הפנימיים של התעלות יהפכו להידרופיליים.

לאחר מכן אמלא אותו במים ואקח אותו למערך האלקטרופיזיולוגיה כדי שנוכל לבצע את הניסויים בפועל. אוקיי, כעת אנחנו מוכנים לעבור למערך האלקטרופיזיולוגיה ולהשתמש במכשיר זה עם פרוסת המוח. היי, שמי הוא uo.

אני עובד עם ד"ר Arrington וד"ר Fall, מהמחלקה להנדסה ביו-רפואית באוניברסיטת אילינוי. כעת אני עומד לעבוד עם התקן ה-micro free שהבאתי, פשוט מעל הפלטפורמה הזו. בצד אחד, ניתן לראות את צינורות הפרפוזיה.

בצד השני, ניתן לראות את צינור השאיבה. המכשיר יעבור פרפוזיה עם תמיסת CSF, המועשרת בבועות של 95% חמצן ו-5% CO2. כעת, לאחר שמכשיר ה-micro V מוכן, אקח את פרוסות המוח ואניח אותן על גבי המכשיר המיקרוסקופי.

כעת אני אבצע הנחה של פרוסת המוח על הפתחים המעגליים, ולאחר מכן אשתמש בעגנים כדי לקבע את פרוסת המוח. כעת, כאשר פרוסות המוח מקובעות, אשתמש במוליכים עצביים כדי לגרות אותן. כאן ישנם ארבעה פתחי כניסה, לכן אכניס מוליך עצבי לכל פתח כניסה באמצעות שאיבה פסיבית מארבעת פתחי הכניסה הללו ועד לפתח היציאה.

ועכשיו ד"ר Fall ידבר על המכשיר הזה. מדוע הוא כל כך חשוב עבורנו? שלום, אני כריס Fall ואנו עוסקים בפיזיולוגיה של המוח.

והסיבה לכך שעלינו להשתמש בחתכי מוח היא כדי לאפשר גישה באמצעות מיקרו-אלקטרודות וטכנולוגיית דימות. עד כה, הדרך היחידה שבה יכולנו לשנות את סביבת המוליכים העצביים עבור חתכי מוח אלה הייתה לשנות את הזרימה על פני החתך כולו, או להתיז מוליכים עצביים ישירות באמצעות מיקרו-פיפט קטן מאוד. לכן, אנו נרגשים מאוד לעבוד עם הקבוצה של Eddington.

טכנולוגיה חדשה זו תאפשר לנו לטפל באזורים נרחבים של המוח ולשנות באופן מקומי את סביבת המוליכים העצביים. לאחר מכן נוכל להיכנס בו-זמנית עם האלקטרודות ועם טכנולוגיית ההדמיה שלנו, ואולי בסופו של דבר להטמיע התקני הקלטה רב-אלקטרודיים באותה יחידה. אוקיי, כאן אתם רואים פרוסה של מוח עכבר בתוך ההתקן המיקרופלואידי.

ניתן להבחין אפילו בעין שהמוח מורכב מאזורים רבים ושונים. אזורים אלה ממלאים תפקידים שונים. ובחיה חיה, לאזורים שונים אלה של המוח יהיו טונים שונים של נוירומודולטורים ומוליכים עצביים.

ואנו רוצים להיות מסוגלים לשחזר זאת בתא הפרוסות שלנו תוך כדי ביצוע הקלטות אלקטרופיזיולוגיות והדמיה. לכן, זהו יתרון משמעותי להיות מסוגלים לפעול על אזורים שונים אלו באמצעות מוליכים עצביים שונים, בריכוזים שונים ובמסלולי זמן שונים. ומכיוון שאיננו יכולים להדמות את המוליכים העצביים באופן ויזואלי, נוכל להראות לכם כאן דוגמה של צבע פלואורסצנטי המוזרק אל תוך פרוסת המוח באזורים שונים.

כאן אתם רואים סרטון שבו אנו מזרימים צבע פלואורסצנטי דרך התעלות של ההתקן, ופשוט מדמיים את יציאתו מהנקבים שנוצרו. ואפילו באב-טיפוס מוקדם זה, ניתן לראות עד כמה הרזולוציה המרחבית של הזרימה מדויקת. בעודנו צופים בסרטון, תראו את הצבע זורם אל תוך התעלות ואז החוצה מהחורים, ולאחר מכן נשטוף את הצבע החוצה, מה שייתן לכם מושג לגבי הרזולוציה הזמנית של הזרימה.

תודה שהצטרפתם אלינו היום. אני מאמין שהצלחנו להדגים כיצד מיקרופלואידיקה, ולמעשה מכונות מיקרוסקופיות, יכולות להשתלב עם טכניקות פיזיולוגיות מסורתיות כדי לסייע לנו להבין כיצד המוח פועל. תודה.