תצפית ישירה של ה-DNA אנזימים שכפול באמצעות DNA מולקולה בודדת מתיחה Assay

סרטון זה מדגים פרוטוקול להדמיית שכפול DNA באמצעות מיקרוסקופיה אופטית בשטח רחב (widefield) של DNA מסוג למבדה ליניארי ומודגמר כימית. ה-DNA מחובר לכיסוי זכוכית פונקציונלי. הקצה החופשי של ה-DNA מסומן בחרוז (bead) וה-DNA נמתח באמצעות זרימה למינרית.

עם תחילת השכפול, הגדיל הstrand המוביל להתארך והstrand המפגר מתקצר עקב קלייה. ההבדל הגדול באורך בין DNA דו-גדילי ל-DNA חד-גדילי בכוחות נמוכים מאפשר תצפית ישירה על המרות DNA במהלך השכפול. אורך מבנה ה-DNA מנוטר על ידי מעקב אחר מיקום החרוז, דבר המאפשר קביעה מדויקת של קצב ותהליך השכפול של ה-DNA.

שלום, אני ארי אולריך מהמעבדות של אנטוני וניאן וצ'ארלס ריצ'רדסון במחלקה לכימיה ביולוגית ופרמקולוגיה מולקולרית בבית הספר לרפואה של הרווארד. היום נדגים לכם פרוצדורה לדימוי של רפליקציית DNA ברמה המולקולרית הבודדת. אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדותינו כדי לחקור פעילויות אנזימטיות המתרחשות במהלך סינתזת DNA.

אם כן, נתחיל. בתחילת הליך זה, DNA של פאג למבדה (Lambda) של חיידקים בלינאריזציה עובר שינוי באמצעות אוליגונוקלאוטידים כדי ליצור מזלג רפליקציה, זרוע מזלג משלימה למבדה, זרוע מזלג ביוטינילית ופריימר למזלג. זרוע המזלג הביוטינילית מכילה ביוטין המחובר לקציו של הקצה ה-5', מה שמאפשר עיגון של תבנית ה-DNA לפני השטח של תא הזרימה.

ה-lambda DNA עובר שינוי נוסף על ידי היברידיזציה (annealing) של אוליגונוקלאוטיד נוסף המכיל קצה diggenin המשמש כתג אימונוגני בעל זיקה גבוהה לחיבור של חרוץ. כדי ליצור את מזלג השכפול, השג lambda DNA בנוסף למספר אוליגונוקלאוטידים שאת רצפיהם ניתן למצוא בפרוטוקול הכתוב המצורף לסרטון זה. אוליגונוקלאוטידים אלה כוללים זרוע מזלג ביוטינילית, זרוע מזלג משלימה ל-lambda, פריימר למזלג, וקצה diggenin משלים ל-lambda; בצע פוספורילציה לקצוות ה-5' של זרוע המזלג המשלימה ל-lambda ושל קצה ה-diggenin המשלימה ל-lambda באמצעות T4 polynucleotide kinase.

לאחר מכן, ערבבו את זרוע המזלג המשלימה של ה-lambda המפוספורלת, את זרוע המזלג הביוטינילית, את הפריימר של המזלג ואת ה-lambda DNA ביחס מולרי של 10 ל-10 ל-100 לאחד. בבופר T4 DNA Ligase, חממו את התערובת בטמפרטורה של 65 °C למשך חמש דקות וקררו באיטיות לטמפרטורת החדר על ידי כיבוי בלוק החימום כדי לאפשר אנילינג תקין של האוליגונוקלאוטידים, והוסיפו לתערובת T4 DNA ligase והדגירו למשך שעתיים. בטמפרטורת החדר, T4 DNA Ligase יקטלז את איטום השברים (nicks) בין האוליגונוקלאוטידים ל-lambda.

לבסוף, הצמידו את הקצה של ה-lambda complementary diggen לתבנית השכפול של ה-DNA על ידי הוספת ה-phosphorylated lambda complementary diggen והקצה ב-T four Ligase buffer; הדגירו את התערובת למשך 30 דקות ב-45 °C ולאחר מכן קררו אותה באיטיות לטמפרטורת החדר על ידי כיבוי ה-heat block. חברו (ligate) את ה-phosphorylated Lambda complementary dig oxygen והקצה לתבנית השכפול של ה-DNA על ידי הוספת T four DNA ligase לתערובת והדגירו למשך שעתיים בטמפרטורת החדר. תבנית השכפול הסופית של ה-DNA מוכנה כעת לשימוש. כדי להצמיד את ה-tassel activated magnetic beads לתבנית השכפול של ה-DNA, יש להפעיל אותם (functionalize) באמצעות פרגמנט FAB הספציפי ל-digo genin.

כדי להתחיל בתהליך זה, השביה מחדש את תמיסת המלאי של החרוזים והעבר 400 µL לשפופרת איפנדור. הנח את השפופרת במפריד מגנטי והדגרה עד שהתמיסה תהפוך שקופה. לאחר מכן, הסר את הנוזל העליון באמצעות פיפטה. כדי להפעיל את קבוצות התיאול לצמידה של נוגדנים, הוסף 1 mL של בופר קישור וערבב בעדינות באמצעות פיפטה.

שוב, הסירו את הנוזל העליון בעזרת מפריד מגנטי. לאחר מכן, הוסיפו 240 µL של מקטע FAB והשעיכו את החרוזים ב-400 µL של בופר בוראט. ערבבו היטב והמתינו לדגירה על רוטטור למשך 16 עד 24 שעות בטמפרטורה של 37 °C.

לאחר הדגירה, הפרד את החרוזיים באמצעות המפריד המגנטי והסר את הנוזל העליון (supernatant). שטוף את החרוזיים ב-1 mL של בופר שטיפה והדגר למשך חמש דקות ב-4 °C, ולאחר מכן הסר את הבופר באמצעות המפריד המגנטי. חזור על פעולת שטיפה זו פעמיים נוספות.

כדי לחסום את קבוצות ה-tosil החופשיות, הוסף מיליליטר אחד של BSA המכיל tris buffer והדגר במשך ארבע שעות ב-37 °C. לאחר ההדגרה, הסר את הבאפר מהחרוצים באמצעות מפריד מגנטי, שטוף פעמיים בבאפר וחלק למנות (aliquot). לשימוש, ה-DNA המיועד לשכפול מחובר לכיסויי זכוכית (cover slips) שעברו פונקציונליזציה עם Amil lane.

קבוצת האוקסי של ה-Amil lane נקשרת לזכוכית, ובכך משאירה קבוצת אמין פנויה לקישור למולקולות peg ביוטיניליות. ציפוי זה מסייע בהפחתת קישור לא ספציפי לפני השטח. כדי לנקות ביסודיות את כיסויי הזכוכית, הנח אותם בתוך צנצנות צביעה ומלא את הצנצניות באתנול לסוניקציה.

במשך 30 דקות, שטפו את הצנצנות ומלאו אותן בתמיסת potassium hydroxide בריכוז one molar; בצעו סוניקציה למשך 30 דקות וחזרו על שני השטיפות. עבור תגובת הפונקציונליזציה הראשונה, יש להסיר את כל עקבות המים. מלאו את צנצנות הצביעה באצטון ובצעו סוניקציה למשך 10 דקות.

רוקנו את הצנצנות ומלאו אותן שוב באצטון. המשיכו להוסיף את ריאגנט הסינו (sine reagent) לצנצנות ונערה במשך שתי דקות. לאחר מכן, בצעו כיבוי (quench) באמצעות עודף גדול של מים.

לאחר מכן, ייבשו את הזכוכיות כיסוי על ידי חימום שלהן בתנור בטמפרטורה של 110 degrees Celsius למשך 30 דקות. לאחר מכן, הכינו תמיסת PEG בריכוז של כ-0.2% משקל לנפח. PEG עם ביוטין, כולל מפריד לזכוכיות כיסוי, יאפשר את הפרדת הזכוכיות הכיסוי; העבירו באמצעות פיפט 100 µL על גבי זכוכית כיסוי סילוזיבית יבשה.

הנח כיסוי זכוכית שני מעל. הדגר את כיסויי הזכוכית בתמיסת ה-PEG למשך שלוש שעות. לאחר מכן, הפרד בין כל זוג כיסויי זכוכית ושטוף היטב במים.

הקפידו לשמור על כיסויי הזכוכית כך שהצד הפונקציונלי יהיה פונה כלפי מעלה, מכיוון שרק צד אחד יהיה מצופה ב-peg. לבסוף, ייבשו את כיסויי הזכוכית באמצעות אוויר דחוס ואחסנו אותם בוואקום. בתוך מיבש (desiccator), המשטחים נשארים יציבים למשך חודש אחד לפחות. לכן ניתן להכין עשרות כיסויי זכוכית בסבב אחד ולהשתמש בהם לפי הצורך.

כעת, כאשר זכוכיות הכיסוי מוכנות, ניתן להרכיב את תא הזרימה עבור ניסוי המולקולה הבודדת. ניסוי המולקולה הבודדת מבוצע באמצעות תא זרימה פשוט הבנוי מזכוכית כיסוי פונקציונלית, סרט דבק דו-צדדי, שקופית קוורץ וצינורית. תא זרימה אחד מוכן עבור כל ניסוי מולקולה בודדת.

התחילו בערבוב של חמישה מיליליטר של בופר חסימה (blocking buffer) ו-20 מיליליטר של בופר עבודה, והניחו את התערובת בדסיקטור כדי להסיר בועות אוויר לשלבים הבאים. לאחר מכן, פזרו 100 מיקרוליטר של תמיסת עבודה של strp din ב-PBS על פני השטח של ה-Cover slip הפונקציונלי עם ה-peg, והדגרימו למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר כדי לאפשר ל-strp din להיקשר לביוטין שעל פני השטח. במקביל, גזרו חתיכה של סרט דביק דו-צדדי שתתאים לגודלו של נסף הקוורץ וסמנו על הסרט את מיקומם של חורי הצנרת.

שרטטו את תא הזרימה על ידי ציור תעלה מרכזית ברוחב של 3 mm ומלבנים המכילים את שני החורים. ניתן לתכנן תאי זרימה עם שני תעלות כניסה ושתי תעלות יציאה בצורת Y. כעת גזרו את הסרט המסומן לאורך קו המתאר ששורטט, תוך ביצוע חתכים ישרים ונקיים כדי להבטיח ששום חומר דביק אינו בולט אל תוך התעלה.

נקה את שקופית הקוורץ ביסודיות באמצעות אצטון כדי להסיר דבק מהבניית תא הזרימה ששימשה בניסויים קודמים. מצא את היישור המיטבי של מתאר התעלה. הסר צד אחד של גב הדבק והנח בזהירות את הסרט על שקופית הקוורץ.

הקפידו ליישר את הסרט כראוי, שכן חורי הכניסה והיציאה חייבים להישאר פתוחים. לאחר מכן, הכינו את אורכי החיתוך של צינורות בעלי קוטר פנימי של 0.76 millimeter עבור הכניסה והיציאה של תא הזרימה. חתכו את קצה הצינור בזווית של כ-30 מעלות, כדי שהצינור לא יילחץ בצורה שטוחה אל תחתית התא.

תלה את הצינורות על מעמדי מבחנות כדי להקל על חיבורם לתא הזרימה בשלבים הבאים. בשלב זה, הדגירה של הזכוכית המכסה צריכה להסתיים. שטוף את הזכוכית המכסה ביסודיות במים וייבש אותה באמצעות אוויר דחוס.

הקפידו לא להפוך את לוחית הכיסוי, שכן רק צד אחד שלה פונקציונלי עם peg. השלימו את הרכבת תא הזרימה על ידי הסרת הצד השני של גב הסרט והנחת פרוסת הקוורץ על לוחית הכיסוי. לחצו קלות על לוחית הכיסוי כדי לדחוק החוצה אוויר שנלכד בדבק. פעולה זו תסייע במניעת חדירת בועות אוויר לתעלת הזרימה.

אטמו את דפנות התא באמצעות אפוקסי. הכניסו את הצינורות הגזורים לתוך החורים שבקוורץ ואטמו אותם במקומם עם האפוקסי. הניחו לייבוש למשך מספר דקות.

לאחר הייבוש, השתמשו במחט מדד 21 כדי למשוך חלק מתמיסת החסימה (blocking buffer) של ה-DGAs דרך אחד הצינורות על מנת לחסום את פני השטח של התא. שטפו את התא מספר פעמים כדי להסיר בועות אוויר והמתינו שהתא ידגרא למשך 30 דקות לפחות לפני המעבר לניסוי השכפול של מולקולה בודדת. לאחר שהחרוזיים הפונקציונליים עם תבנית ה-DNA ותא הזרימה הוכנו, ניתן לבצע ניסוי של מולקולה בודדת.

ראשית, הניחו את תא הזרימה על במת המיקרוסקופ. קבעו את התא במקומו באמצעות תסביכי הבמה וודאו שניתב הזרימה מיושר עם מצלמת ה-CCD. חברו את קפיץ האוויר שנבנה מראש למשאבת המזרק ולצינורות היציאה של תא הזרימה.

בעזרת צינורות חיבור בעלי קוטר גדול יותר, מקמו את צינורות הכניסה של תא הזרימה בתוך תמיסת חסימה (blocking buffer) ומשכו את הבוחנה של המזרק לאחור כדי להוציא בועות אוויר מהצינורות; נקשו בעדינות על צינורות היציאה כדי לשחרר בועות אוויר כלשהן הלכודות בתא הזרימה. לאחר שכל בועות האוויר הוסרו, חסמו את אחד מצינורות הכניסה באמצעות מחט ואטמו את אחד מצינורות היציאה על ידי כיפופו ב-180 מעלות וקיבועו באמצעות סרט דביק. לפני הוספת ה-DNA לתא, דללו את תבנית ה-DNA מהמלאי לריכוז של 10 picomolar בתוך מיליליטר אחד של DGAs one x blocking buffer. הזרימו את התבנית אל התא בקצב זרימה בינוני כדי לאפשר כיסוי פני שטח טוב של ה-DNA.

דללו את תמיסת חרוזי המלאי לריכוז שבין 2 ל-4 כפול 10⁶ חרוזים למיליליטר, בתוך מיליליטר אחד של DGAs one x blocking buffer. לאחר מכן, ערבבו את התערובת באמצעות וורטקס ובצעו סוניקציה למשך 20 שניות.

הזרים את תמיסת החרוצים המדוללת אל תוך התא. לאחר הוספת החרוצים, הפסק את הזרימה ואפשר לתא להגיע לשיווי משקל. לאחר מכן, סגור את שני צינורות היציאה.

כל שינוי במבובות כאשר התא אינו סגור יגרום לתנודות בלחץ שיפעילו כוח חזק על החרוצים ויגרימו לקטיעה של מולקולות ה-DNA המקובעות. חסום באמצעות מחט את מבובת הכניסה ששימשה לטעינת החרוצים, תוך שימוש במבובת הכניסה השנייה. התחל בשטיפה של תא הזרימה עם תמיסת blocking buffer בריכוז one x של DGAs באופן נרחב.

הקשו על הבמה כדי להניע אותה ולהסיר חרו지를 שנדבקו לפני השטח באופן לא ספציפי לצורך בדיקה. החרוזים קשורים ל-DNA. נסו לשנות את כיוון הזרימה.

לאחר הסרת מספיק חרוזיים חופשיים, כבה את הזרימה ואפשר לתא להגיע לשיווי משקל. הכן תערובת תגובה טרייה המכילה חלבוני רפליקציה כפי שמפורט בפרוטוקול הטקסט. סגור את צינור היציאה הפתוח והעבר את מאגר הכניסה לתערובת התגובה שהוכנה זה עתה.

פתח באיטיות את מוצא המערכת כדי למנוע שינויי לחץ מהירים ולהמשיך בתגובה האנזימטית. ראשית, הזרם את תמיסת החלבון אל התא בקצב זרימה בינוני כדי לאפשר קישור יעיל ל-DNA. כבה את הזרימה והמתן עד שהתא יגיע לשיווי משקל.

סגרו את צינורות היציאה והחליפו את הצינור המכיל את תערובת התגובה. באמצעות הצינור המכיל את באפר השטיפה של ה-DGAs, שטפו את התא כדי להסיר חלבונים חופשיים לאחר השטיפה. שוב, כבו את הזרימה והמתינו עד שהתא יגיע לשיווי משקל.

סגרו את צינורות היציאה והחליפו את הצינור המכיל בופר שטיפה. השתמשו בצינור המכיל בופר רפליקציה T7; בופר רפליקציה T7 מכיל מגנזיום כלוריד המפעיל את תחילת תגובת הרפליקציה. השתמשו בקצב זרימה של 0.012 milliliters per minute, המתאימה לכוח גרירה של שלושה pico Newtons על עיגוני ה-DNA תחת התנאים המתוארים בפרוטוקול זה.

הנח מגנט קבוע של נדיר-עפר מעל תא הזרימה לפני הדימות כדי למנוע אינטראקציות לא ספציפיות בין החרוזיים לפני השטח. מקם מאיר סיב אופטי בזווית פגיעה שבין 10 מעלות לבין מקביליות לבמה של המיקרוסקופ, סמוך לשדה הראייה של המיקרוסקופ עם עדשה של 10x ומצלמת CCD. תאורת שדה אפל משמשת להגברת הניגודיות במיקוד הדימות של החרוזים באמצעות חרוז קשור.

התחל ברכישת נתונים למשך 20 עד 30 דקות בקצב פריימים נמוך. בניסוי מוצלח, ניתן להבחין ב-100 חרו지를 בו-זמנית. הניסוי אמור להניב עקבות רבות המציגות סינתזה של DNA בגדיל המוביל.

על מנת למדוד את קצבי פתיחת ה-DNA והפולימריזציה ואת הפרוססיביות שלהם, יש לקבוע במדויק את מיקומי החרו지를. התאימו מיקומים אלו לפונקציות גאוסיאניות דו-ממדיות. הדמיעו את המסלול על ידי מעקב אחר מיקום החרוז בכל פריים באמצעות תוכנת מעקב.

לאחר מכן, שרטטו את מיקום החרוד כפונקציה של זמן באמצעות כל תוכנה גרפית כדי לקבל נתונים על הקצב. התאימו את הגרפים באמצעות רגרסיה ליניארית וחשבו את השיפוע עבור התהליך הפרוססיבי. קבעו את האורך הכולל של ה-DNA מתחילת אירוע הקיצור ועד לסיומו.

יש לשלב את כל המדידות הבודדות ולהפיק גרפים של התפלגויות הקצב והפרודוקטיביות, תוך התאמת הנתונים לפונקציות גאוסיאניות ואקספוננציאליות בודדות בהתאמה. כעת הצגנו כיצד למדוד קצבים ותהליכי רצף (processivity) של רפליקציית DNA ברמה של מולקולה בודדת. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לוודא שהכוח והמתח הנוצרים כתוצאה מזרימה למינרית אינם משפיעים על הפעילות האנזימטית של חלבוני הרפליקציה.

זהו זה. תודה שצפיתם, ובהצלחה בניסוייכם.