מולקולה בודדת פשוטה, חסון וגבוה התפוקה זרימה מתיחה Assay יישום לימוד התחבורה של מולקולות לאורך הדנ א

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבנות מבחן מתיחת זרימה של מולקולה בודדת פשוטה, חזקה ובעלת תפוקה גבוהה לחקר הובלת מולקולות לאורך ה-DNA. זה מושג על ידי הכנת DNA למבדה המסומן בביוטין על ידי קשירת אוליגו עם תווית ביוטין ל-DNA למבדה. השלב השני הוא הכנת כיסויים פונקציונליים של פוליאתילן גליקול או PEG על ידי ביצוע פרוטוקול תגובה חד-שלבי.

לאחר מכן, תא זרימה בתפוקה גבוהה נבנה על ידי סנדוויץ' סרט דו צדדי עם תעלות חתוכות מראש בין כיסוי פונקציונלי PEG ללוח פולידימתילסילוקסן או PDMS המכיל חורי כניסה ויציאה. השלב האחרון הוא לעקוב אחר מסלולים של מולקולות פלואורסצנטיות בודדות בערוץ הזרימה על ידי שימוש בהדמיית השתקפות פנימית כוללת או הדמיית TIRF. כדי לזהות את המסלולים של מולקולות בודדות המפוזרות לאורך ה-DNA הלמבדה המתוח בזרימה, נעשה שימוש בתוכנת מעקב אחר חלקיקים בודדים אמינה ויעילה לניתוח תמונות פלואורסצנטיות גולמיות.

היתרונות העיקריים של תצורת בדיקה זו על פני חלופות הם האמינות של הכנת כיסוי, יכולת תפוקה גבוהה יותר, זמן מעשי מופחת להכנת דגימה וניתוח נתונים יעיל יותר ללא פיקוח. הדגמת ההליך תהיה פוסט-דוקטורנט במעבדה שלי, ד"ר קאן שיונג. לפני תחילת בדיקה זו, הכן את כל הריאגנטים הדרושים כמתואר בטקסט הפרוטוקול.

מחממים 0.5 מיליגרם למיליליטר למבדה-DNA ל-65 מעלות צלזיוס למשך 60 שניות וצוללים מיד לקרח רטוב. מערבבים 100 מיקרוליטר מתמיסת הלמבדה-DNA עם שני מיקרוליטרים של 10 אוליגו מיקרו-מולרי עם תווית ביוטין בתוך צינור מיקרוצנטריפוגה. מחממים את התערובת בחום של 65 מעלות צלזיוס למשך 60 שניות ואז מצננים לאט לטמפרטורת החדר.

מניחים את התערובת על קרח. הוסף 11 מיקרוליטר של מאגר תגובת ליגאז T4 DNA וערבב בעדינות. ואז שני מיקרוליטר שווי ערך ל -800 יחידות של T4 DNA ligase ומערבבים בעדינות.

דוגרים על התערובת במשך שעתיים בחום של 16 מעלות צלזיוס או לילה בחום של ארבע מעלות צלזיוס. טהר את המוצר באמצעות צינורות סינון צנטריפוגליים עם מגבלת משקל מולקולרית נומינלית של 100 קילודלטון. כיסוי סוניקט מספר אחת מחליק אתנול 95% בתוך צנצנת מכתים למשך 10 דקות ולאחר מכן שוטף במים טהורים במיוחד שלוש פעמים.

מלאו את צנצנת הצביעה באשלגן הידרוקסיד טוחנת אחת, סוניקטו שוב למשך 10 דקות, ולאחר מכן שטפו במים טהורים במיוחד שלוש פעמים. חזור על מחזור זה פעמיים. יבש את הכיסויים תחת זרימת גז חנקן יבש ונקי.

נקו וייבשו עוד יותר את הכיסויים על ידי ביצוע טיפול בפלזמת אוויר בלחץ של 900 מיליטור למשך חמש דקות. דגירה של כיסויים עם 50 מיקרוליטר של 25 מיליגרם למיליליטר סילאן-פוליאתילן גליקול-ביוטין מומס באתנול 95% בטמפרטורת החדר למשך שעתיים. שטפו עודפי פוליאתילן גליקול במים טהורים במיוחד וייבשו את הכיסויים המצופים בפוליאתילן גליקול תחת זרימת גז חנקן נקייה ויבשה.

תכנן תעלות זרימה באמצעות תוכנת CAD וחתוך את הערוצים על סרט דו צדדי באמצעות חותך סרט. הסר שאריות קלטת בתוך הערוצים. להכנת לוחות PDMS, מערבבים היטב 45 גרם PDMS עם חמישה גרם מגיב צולב באמצעות מערבל.

יוצקים את התערובת לשתי צלחות פטרי של 100 מילימטר ומשאירים את הכלים בתוך תא ואקום למשך כ -30 דקות עד שכל בועות האוויר נעלמות. השאירו את הכלים בתוך תנור 80 מעלות צלזיוס למשך כשעתיים עד שה-PDMS מתמצק. גזרו לוח PDMS התואם את גודל הקלטת הדו-צדדית עם תעלות חתוכות מראש.

קלף סרט הגנה אחד מהסרט הדו-צדדי והדבק לצד שטוח של לוח ה-PDMS. נקב חורי יציאה וכניסה על לוח ה-PDMS באמצעות מנקב חורים ביופסיה עם מחט בגודל 23. קלף את סרט ההגנה השני מהסרט הדו-צדדי והדבק למשטח הפונקציונלי של הכיסוי.

תקן את תא הזרימה המורכב על תוספת שלב מיקרוסקופ. טען את כל הריאגנטים שהוסרו מראש לתוך מאגרים שיש להם צינור טיגון המחובר לשסתום סולנואיד וצינור נוסף המחובר לצינור PEEK שימנע זרימה חוזרת של ריאגנטים. זרימת הריאגנטים נשלטת על ידי שסתומי סולנואיד הנשלטים על ידי יישום תכנות סקריפטים.

ראש ערוץ זרימה אחד על ידי זרימה במאגר ריק. הכנס שלושה צינורות הצצה נוספים לתוך חורי הכניסה. היזהר לא לגרום להיווצרות בועות אוויר בתוך התעלה.

חבר צינור טיגון עם צינור הצצה קצר מחור היציאה למיכל פסולת לדוגמה. זורמים 0.2 מיליגרם למיליליטר תמיסת סטרפטווידין ודוגרים למשך חמש דקות. לאחר מכן זרמו במאגר ריק כדי לשטוף את הסטרפטווידין הלא כבול.

יש לזרום במיליגרם אחד לכל תמיסת אלבומין בסרום בקר ולדגור למשך דקה אחת. לאחר מכן זרמו במאגר ריק כדי לשטוף את אלבומין סרום הבקר הלא כרוך. זורמים בתמיסת 100 פיקומולרית ביוטין-למבדה-DNA ודוגרים למשך 10 דקות.

לאחר מכן זרמו במאגר ריק כדי לשטוף את ה-DNA הלמבדה הלא קשור. כדי לבדוק את איכות הכיסוי הפונקציונלי של PEG, זרום צבע צביעת DNA כגון צבע כתום SYTOX והתחל בהדמיית פלואורסצנטיות. אם איכות הכיסוי טובה, צפיפות הזרימה של למבדה-DNA מתוח תהיה גבוהה.

כמו כן, כוונן את זווית ה-TIRF כדי להשיג את יחס האות לרעש הגבוה ביותר של תמונות של DNA למבדה מתוח כמעט במלואו. כדי לעקוב אחר מסלולים של מולקולות בודדות, התחל דגירה בתוך תעלה חדשה ולאחר מכן התיך מולקולות תת-ננו-מולריות, המסומנות בפלואורופור בקצב זרימה גבוה מספיק באמצעות משאבת מזרק ואסוף תמונות פלואורסצנטיות בקצב פריימים של 100 הרץ. בדרך כלל נאספים 10,000 פריימים בשדה ראייה אחד ונאספים סרטים ממספר שדות ראייה.

בסוף, זרום שוב בצבע צביעת DNA כדי לאשר שעדיין ניתן למתוח את ה-DNA. תוכנת מעקב אחר חלקיקים בודדים מותאמת אישית תשמש לזיהוי מסלולים של מולקולות בודדות המתפזרות לאורך ה-DNA. התוכנה תקבע תחילה את המיקומים המרכזיים של חלקיקים בודדים בעלי דיוק גבוה.

הסר חלקיקים שנתקעו על משטח הכיסוי ולאחר מכן קשר חלקיקים במסגרות שונות ליצירת מסלולי זמן-lapse. ממסלולים אלה, קבועי הדיפוזיה החד-ממדיים יוערכו. כדי להתחיל בניתוח נתונים, פתח יישום תכנות סקריפטים ועבור לספרייה של תוכנת המעקב אחר חלקיקים בודדים.

פתח קובץ Script בשם largedataprocess3.m. פרמטר חשוב אחד שיש להגדיר הוא ערך הסף לזיהוי חלקיק בודד. כדי לקבוע את ערך הסף האופטימלי, הפעל את determine_threshold_value.

תסריט m. סקריפט זה ימחיש כיצד ערך הסף משפיע על זיהוי חלקיק בודד. לאחר קביעת ערך הסף האופטימלי, הפעל את largedataprocess3.

תסריט m. לאחר השלמת ניתוח מעקב אחר חלקיקים בודדים, המסלולים הגולמיים יסוננו על ידי הפעלת trajectory_filtering. תסריט m.

ממשק משתמש גרפי או ממשק משתמש גרפי בנוי כדי להמחיש את שלב הסינון. בחלונית GUI, הגדר את התזוזה המינימלית לאורך DNA, MinXDisp, לשני פיקסלים. הגדר את התזוזה המקסימלית רוחבית ל-DNA, MaxYDisp, לשני פיקסלים.

הגדר את המספר המינימלי של פריימים, minFrames, ל-10. הגדר את המספר המינימלי של מצבים של שלישייה, minTriplets, ל-10. הגדר את קבוע הדיפוזיה המינימלית לאורך ה-DNA, D_par להיות אפס.

הגדר את קבוע הדיפוזיה המשוער המקסימלי רוחבי ל-DNA, D_trans, ל-10 מגה זוג בסיס בריבוע לשנייה. הגדר את הפרמטר הסטטיסטי המינימלי, Chi2 Stat, למינוס חמש. הגדר את היחס המינימלי של תזוזה לאורך ה-DNA לרוחבי ל-DNA, MinX/Y, לשניים.

כל המסלולים הגולמיים שעוברים את פרמטרי הסינון הללו יופיעו בטבלה הראשונה ואלה שלא יעברו יופיעו בטבלה השלישית. לחץ על מספר מסלול בטבלה הראשונה. המסלול יוצג בגרפיקה אחת ושתיים.

לחץ על כפתור ההפעלה כדי להפעיל את תמונות הקרינה הגולמיות. לחץ על הוסף לטבלה2 אם מסלול זה הוא מסלול הזזה של מולקולה בודדת. בסופו של דבר, כל המסלולים שנוספו לטבלה 2 יישמרו בעת סגירת ממשק המשתמש הגרפי.

המסלולים שעברו את כל שלבי הסינון מאוגדים יחד שמהם יוערך קבוע הדיפוזיה הממוצע. כדי לחשב את קבועי הדיפוזיה הממוצעת, פשוט הפעל את הסקריפט calculate_mean_diffusion_constant.m. הליך זה יועיל לאנשים רבים הלומדים ביופיזיקה של מולקולה בודדת במבחנה.