הדמיה ב-RNA לוקליזציה Xenopus ביציות
14 בינואר 2010
ויזואליזציה של In vivo RNA תחבורה מושגת על ידי microinjection של תעתיקי רנ"א שכותרתו fluorescently לתוך Xenopus ביציות, ואחריו מיקרוסקופיה confocal.
בפרוצדורה זו, מוזרקים תסריטי RNA המסומנים פלואורסצנטית לתוך ציטות של XUS ומיקומם מנוטר. ראשית, ה-RNA מסומן עם נוקלאוטידים פלואורסצנטיים.
בתגובת תמלול in vitro, ה-RNA נטען לאחר מכן למכשיר מיקרו-הזרקה. הביציות מונחות בצלחת הזרקה ועוברות מיקרו-הזרקה בזהירות. לבסוף, הביציות נתרחמות כדי לאפשר להתרחשות לוקליזציה של ה-RNA לפני הדמיה במיקרוסקופ קונפוקאלי.
שלום, אני ג'יימס גניאן מהמעבדה של ד"ר קימברלי מלורי במחלקה לביולוגיה מולקולרית, ביולוגיה של התא וביוכימיה באוניברסיטת בראון. היום נדגים לכם פרוצדורה להדמיה של לוקליזציה סוב-צלולרית של RNA באוציט של Xap. אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדתנו כדי לחקור את ארכיטקטורת ה-RNA ואת הגורמים החלבוניים הדרושים ללוקליזציה של RNA במהלך התפתחות מוקדמת של חולייתנים.
אם כן, בואו נתחיל. כדי להתחיל בפרוצדורה זו, בצעו תמלול של mRNA, המסומן הן רדיואקטיבית והן פלואורסצנטית כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב המצורף. הוסיפו DNase כדי לפרק את ה-DNA התבנית, ולאחר מכן עצרו את התגובה על ידי הוספת EDTA.
הסר נוקלאוטידים שלא נקשרו ומולקולות קטנות אחרות על ידי סבב (spinning) דרך עמודת G 50. לאחר מכן רכז את ה-RNA באמצעות שקיעת אתנול, שטוף אותו והמס אותו מחדש. לאחר קביעת הריכוז באמצעות ספירה ניצוטית (scintillation counting), דלל את ה-RNA ל-50 nano molar ואחסן במנות (aliquots) של five microliter בטמפרטורה של minus 80 degrees Celsius.
בעת ההכנה לביצוע המיקרו-הזרקה, הפשיר אלקווא (Eloqua) של ה-RNA המסומן והדנאטורה בטמפרטורה של 70 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. לאחר מכן, סובב במשך 10 דקות במהירות מרבית במיקרו-צנטריפוגה בטמפרטורה של חדר כדי להסיר חלקיקים, ושמור על קרח. כעת, בודד את התאים: העבר חתיכות של שחלה מ-*Xenopus laevis* לתוך מבחנה קונית של 50 מיליליטר המכילה 25 מיליליטר של 3 מיליגרם למילליטר.
Collagenase בבופר פוספט פוטסיום 0.1 מולרי ב-pH 7.4. נערו בעדינות בטמפרטורה של 18 degrees Celsius בשל שונות בין סדרות ייצור. זמן הטיפול ב-Collagenase עשוי להשתנות ויש לנטרו בקפידה באמצעות בדיקה ויזואלית.
כדי להבטיח הפלה של העלים, המשיכו לנער במשך 15 דקות או עד שהציטות יופרדו באופן גלוי מהשחלה, ואפשרו לציטות לשקוע לתחתית הפרועת הקונית. הסירו את התמיסה והחליפו אותה בבופר MBSH. חזרו על פעולה זו, ושטפו פעמיים נוספות, לסך הכל שלושה שטיפות.
בשלב הבא, מיין ידנית תאי ביצה (CYTES) בשלב שלושה עד ארבעה ובפר ביומב (MBSH buffer) תחת מיקרוסקופ אור סטנדרטי. תאי ביצה בשלב שלושה הם אטומים לחלוטין, אך לבנים. בעוד שתאי ביצה בשלב ארבעה גדולים מעט יותר ומנוקדים בפיגמנט.
ציטות השקופות במקצת הן צעירות מדי, וציטות בעלות פיגמנטציה מלאה או כאלה המראות התפלגות פיגמנטים מקוטבת הן ישנות מדי. לבסוף, הכינו את המחטים להזרקה זעירה (microinjection) באמצעות קפילריות של שלושה וחצי אינץ', על ידי משיכה והשחזה כדי ליצור מחטים בעלות קוטר חיצוני של כ-0.05 millimeters. כעת, כאשר ה-mRNA, הציטות והמחטים מוכנים, עברו לשלב ההזרקה הזעירה.
התחילו בכיול המחט עם מי תהסמיה (desy water) כדי להחדיר שני ננומטרים בכל הזרקה. טענו את המחט באמצעות מיקרו-מזרק מבוקר גז וכיילו את גודל הטיפה באמצעות מיקרומטר. לאחר הכיול, טענו את ה-RNA המיועד להזרקה לתוך המחט. לאחר מכן, הניחו את הביציות הממוינות על צלחת הזרקה בבופר MBSH; הצלחת מכילה שכבה של גומי-ספוג שחור.
הציטות הלבנות בולטות היטב על רקע שחור. לאחר מכן, מזריקו בזהירות לכל ציטה 2 liters של RNA בריכוז 50 nanomolar. ודאו שאתם מזריקים לכל ציטה פעם אחת בלבד, ובדקו את המחט באופן קבוע לאטימה לאחר השלמת ההזרקה.
רוקנו את שארית ה-RNA, שטפו את המחט במים מזוקקים וטענו את ה-RNA הבא להזרקה. לאחר ההזרקה, העבירו את התאים המוזרקים לבאר של פלטת 24 בארות סטרילית; ניתן לתרבת עד אלף תאים בכל באר.
הסיר את התמיכה והחלפה אותה ב-400 µL של מצע גידול לתאי cyte לכל באר. לאחר מכן, הנח את פלטת התרבית בתוך מיכל פלסטיק עם נייר סופג רטוב כדי לשמור על סביבה לחה במהלך התרבית, והדגר את הציטות בטמפרטורה של 18 °C למשך נקודות זמן שנעות בין שמונה ל-48 שעות לאחר תקופת ההדגרה הרצויה. ניתן להכין את הציטות למיקרוסקופיה לאחר הדגרת הציטות המוזרקות.
הפרידו את התאים המתים והניחו את התאים השורדים בתוך מבחנות זכוכית. באופן שגרתי נצפה שיעור הישרדות של יותר מ-90% מהתאים. החליפו את התמיכה בקיבוע M-E-M-F-A וטלטלו את התאים במשך 20 דקות.
הגנו את הביציות מאור שמש במהלך הקיבוע ולאחר סיום תקופת הקיבוע. שטפו את הביציות על ידי הסרת חומר הקיבוע והחלפתו בנפח שווה של תמיסת MBSH. חזרו על שטיפה זו פעם נוספת, לסה"כ שתי שטיפות.
בשלב הבא, שטפו את ה-oocytes למתנול אנहाइडרוס. ראשית, הסירו מחצית מהנפח והחליפו אותו במתנול. חזרו על פעולה זו פעמיים נוספות.
לאחר שטיפות אלו, הסירו את כל התמיסה והחליפו אותה במתנול. חזרו על שטיפת מתנול זו פעם אחת נוספת. ניתן לאחסן את הביציות המקובעות והמוסלקות בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס עד למועד הצילום.
לפני ההדמיה, הוסיפו את תמיסת הבירוח של מארי (Marie's clearing medium) לצלוחית פלואורו של WPI עם תחתית זכוכית כדי לכסות את משטח ההדמיה. העבירו בזהירות את הביציות מהמתנול לצלוחית הפלואורו, תוך מזעור נפח המתנול המועבר, והדמיאו את הביציות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקאלי הפוך; הן ה-Zeiss LSM 510 וה-Aica TCS SP מספקים תוצאות טובות. כעת נראה מספר תמויות מייצגות של לוקליזציה של RNA תת-תאית מיד לאחר מיקרו-הזרקה; RNA פלואורסצנטי נראה בגרעין לאחר שמונה שעות של תרבית של ביקורת מסומנת פלואורסצנטית.
ניתן לראות RNA מפוזר באופן אחיד בציטופלזמה של הביצית. עם זאת, RNA המסומן פלואורסצנטית המכיל רצפים המגייסים את מכבש ההובלה, ניתן להבחין בו בתהליך של לוקליזציה סוב-סלולרית לקוטב הצמחי של הביצית. הרגע הצגנו כיצד לבצע מיקרו-הזרקה של RNA המסומן פלואורסצנטית לתוך ביציות של Xenopus ולהתבונן בלוקליזציה של ה-RNA באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.
בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב להשתמש בתמיסות שעברו טיפול ב-DEPC כדי למנוע זיהום של ה-RNA, לגדל את ה-oocytes ב-OCM המכיל אנטיביוטיקה, ולהגן על ה-oocytes מאור שמש ככל הניתן כדי למנוע פוטובליצ'ינג (photo bleaching). זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר את הוויזואליזציה של מעבר RNA in vivo באמצעות טרנסקריפטים של RNA המסומנים פלואורסצנטית שמוזרקים לאוציטים של Xenopus. מיקומו של ה-RNA מנוטר באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- ביולוגיה של RNA
רקע
- הסעה של RNA חיונית לתהליכים תאיים שונים.
- ציטות של Xenopus משמשות כמערכת מודל לחקר דינמיקה של RNA.
- סימון פלואורסצנטי מאפשר ויזואליזציה של RNA בזמן אמת.
- מיקרוסקופיה קונפוקלית מספקת יכולות דימוי ברזולוציה גבוהה.
מטרת המחקר
- להדמיה של הובלת RNA בתוך תאים חיים.
- להבנת המנגנונים של לוקליזציית RNA.
- לשימוש בשיטה מהימנה לחקר דינמיקת RNA בביציות (oocytes).
שיטות ששימשו
- סימון פלואורסצנטי של תמלילי RNA באמצעות נוקלאוטידים.
- מיקרו-הזרקה של RNA לתוך ציטות (oocytes) של Xenopus.
- תרבית של ציטות כדי לאפשר לוקליזציה של ה-RNA.
- דימוי באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית למעקב אחר הובלת ה-RNA.
תוצאות עיקריות
- ויזואליזציה מוצלחת של הובלת RNA באוציטים.
- הדגמה של יעילות הסימון הפלואורסצנטי.
- תובנות לגבי דפוסי הלוקליזציה של RNA.
- תיקוף של מיקרוסקופיה קונפוקלית ככלי למחקרי RNA.
מסקנות
- השיטה מספקת גישה עוצמתית לחקר הדינמיקה של RNA.
- הממצאים תורמים להבנת מנגנוני ההובלה של RNA.
- מחקרים עתידיים יכולים להתבסס על מתודולוגיה זו כדי להשיג תובנות נוספות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ויזואליזציה של לוקליזציית RNA בסיטיוציטים של Xenopus מאפשרת בחינה ישירה של מנגנוני הובלת RNA, ובכך תומכת בגילויים מוקדמים ובתיקוף מטרות בתחומי קוטביות התא והביולוגיה ההתפתחותית. גישה זו, המבוססת על דימוי, מספקת ביטחון חיזוי למחקרים פונקציונליים של אלמנטים הפועלים בשיטת cis ו-trans, ומסייעת בקבלת החלטות מותאמות סיכון בפיתוח מודלים פרה-קליניים. התוצרים הכמותיים והניתנים לשחזור של השיטה מקלים על מיון הפורטפוליו והפחתת סיכונים מכניסטיים עבור אסטרטגיות טיפוליות המכוונות ל-RNA.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר ויזואליזציה ישירה של לוקליזציית RNA להבהרת נתיבי ההובלה והדטרמיננטים המולקולריים.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של רצפי אלמנטים וגורמי חלבון המעורבים בתעבורת RNA.
- מספק הפחתת סיכונים מכניסטית על ידי הבחנה בין אירועי לוקליזציה ספציפיים לאלו שאינם ספציפיים.
- מקל על חקירה מבוססת היפותזה של אינטראקציות RNA-חלבון הרלוונטיות לפולריות התא.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מבסס בדיקת דימות מתוקפת לכימות דפוסי לוקליזציה של RNA בתאים חיים.
- תומך בסטנדרטיזציה ובשחזור באמצעות פרוטוקולי מיקרו-הזרקה ודימות מבוקרים.
- מאפשר סקילביליות לסריקת השפעות של מולקולות מועמדות או הפרעות גנטיות על טרנספורט של RNA.
- מספק תוצאות כמותיות המתאימות לניתוח השוואתי בין תנאים ניסיוניים שונים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתכתב עם מערכות רלוונטיות למחלה באמצעות מידול של פגמים במיקום ה-RNA המעורבים בהפרעות התפתחותיות.
- מספק רצף משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני על ידי אפשרות לביצוע מחקרים מכניסטיים במודל של חולייתן.
- תומך בקידום מותאם סיכונים באמצעות קישור בין מנגנונים מולקולריים לתוצאות פנוטיפיות באוציטים.
- מציע ערך ניבוי לזיהוי ביומרקרים טרנסלציונליים המבוססים על דינמיקת מיקום ה-RNA.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
טכניקת דימוי זו משתלבת ברצף השלב שבין הגילוי למחקר הפרה-קליני על ידי מתן אפשרות לבדיקת השערות, תיקוף מכניסטי וניתוח כמותי של לוקליזציית RNA במערכת מודל.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בהבהרת מסלולים ובצמצום סיכונים ביולוגיים באמצעות ויזואליזציה ישירה של מעבר RNA.
- סריקה: מספקת מוכנות של בדיקה ושחזור לצורך הערכת ההשפעה של התערבויות מולקולריות על לוקליזציה של RNA.
- אנליטיקה: מספקת פלטי דימות כמותיים להשוואה סטטיסטית חזקה בין קבוצות ניסוי.
- מחקר תרגומי: מקשר בין תובנות מנגנוניות לפנוטיפים רלוונטיים למחלה בהתפתחות מוקדמת של חולייתנים.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פלטפורמה לשימוש חוזר למחקר אירועי לוקליזציה מגוונים של RNA וגורמים רגולטוריים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקרי לוקליזציה של RNA.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה, השחזוריות והיכולת להרחבה (scalability) של בדיקות מבוססות דימוי.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת החלטות ה-go/no-go ואת יעילות ההון על ידי אספקת תוצאות תפקודיות חסונות.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף מותאם סיכון של תוכניות המכוונות ל-RNA בהסתמך על נתונים מכניסטיים מתוקפים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בהזרקה מיקרוסקופית (microinjection), בדימות קונפוקאלי וטיפול ב-RNA.
- דורש גישה לריאגנטים לסימון פלואורסצנטי ותשתית למיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה.
- מחייב סטנדרטיזציה של פרוטוקולי ההזרקה והדימות בין צוותים שונים לצורך שחזוריות.
- עשוי לדרוש התאמה עבור סוגי RNA שונים או מערכות מודל בהתאם לרצף ולמנגנוני ההובלה.
- מגבלות מעשיות כוללות את יציבות ה-RNA, הבהייה פוטוכימית (photo-bleaching) ומגבלות תפוקה הגלומות להזרקה מיקרוסקופית ידנית.
שאלות נפוצות בביופארמה
Chapters in this video
0:00
Title
0:30
Introduction
1:03
Preparing for Microinjection
3:14
Microinjection and Oocyte Culture
4:35
Fixation, Dehydration, and Storage of Oocytes
5:35
Imaging RNA Localization by Confocal Microscopy
5:59
RNA Localization in Xenopus Oocytes: Representative Results
6:28
Conclusion
