הכנת הפרט תסיסנית ביצה צ'יימברס הדמיה חיים
27 בפברואר 2012
תסיסנית ביצה קאמרית הוא מודל מצוין לחקר המנגנונים של לוקליזציה mRNA. על מנת ללכוד את האירועים דינמיים ביסודה של תהליכי לוקליזציה, ברזולוציה גבוהה הדמיה מהירה של רקמה חיה נדרש. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לנתיחה והדמיה של דגימות חי עם הפרעה מזערית.
מטרת הניסוי הבא היא לתעד תהליכים דינמיים באתרי U של זבוב הדרוסופילה החי. זאת מושג תחילה על ידי בידוד שחלאות שלמות מזבובים נקבות בני יומיים שהוזנו היטב. כשלב שני, מוצאים אריולות בודדות מהשחלאות כדי לדגם את תאי הביצה.
לאחר מכן, אם הן מבטאות חלבון פלואורסצנטי מתאים, ניתן לצלם את תאי הביצה הבודדים באופן ישיר או להעביREM אותם מניפולציות נוספות, כגון מיקרו-הזרקה של סממנים פלואורסצנטיים לפני הצילום. בסופו של דבר, באמצעות ניתוח רצפי הסרטונים, ניתן לחשוף את האינטראקציה הדינמית של רכיבים תוך-תאיים. שיטה זו סייעה לנו להשיב על מספר שאלות מרכזיות בתחום של הובלת RNA ותרגום מקומי.
לדוגמה, כיצד מוסדרים בזמן ובמרחב ביצורים חיים ביטויים של חלבונים הקובעים את תוכנית הגוף? באופן כללי, אנשים שאינם בקיאים בשיטה זו יתקשו בביצועה, שכן היא דורשת מהירות ומיומנות ניכרות. באמצעות תרגול של שניהם יושגו תוצאות טובות יותר.
הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן קשה להעביר את המניפולציות של תאי הביצית בטקסט ובשל הצורך במומחיות טכנית ובדיוק בידיים. התחל את ההליך על ידי הנחת טיפה קטנה של שמן halo carbon על זכוכית כיסוי והנח אותה בצד. לאחר מכן, הרדם את הזבובים שהוכנו באמצעות פחמן דו-חמצני.
השתמשו בפינצטה עדינה וחדה כדי לתפוס זבוב נקבה שמן בחלק הקדמי של הבטן. אין לתפוס במרכז הבטן. החזיקו את הנקבה בגובה של כשני עד שלושה סנטימטרים מעל זכוכית הכיסוי שהוכנה.
באמצעות זוג פינצטות שני, הסר את הרקמה בקצה האחורי ביותר של הנקבה. פעולה זו תכלול בדרך כלל רקמות מעי; השתמש בפינצטות נקיות. עסה בעדינות את הבטן מהקצה הקדמי לקצה האחורי, בדומה לסחיטה של משחת שיניים משפופרת.
השחלה נראית כמבנים עמומים וגדולים ותידבק לקצה הפינצטה. אספו את השחלות על ידי נגיעה בהן בשמן פחמן הלו (halo carbon oil) שעל השקף. חזרו על התהליך עד לאיסוף של ארבע עד שש שחלות.
לפני בידוד האיברים התלויים (aerials), כוון את מקור האור במיקרוסקופ כך שהתאורה תפגע בلامדה בזווית רדודה ותיצור צלים מנוגדים על הרקמות. בעת דיסקציה של הזבובים, חשוב מאוד להשתמש בכלים המתאימים.
הצבעון שבו אנו משתמשים אינו חד מדי כדי שלא יפגע ברקמה, אלא קהה למדי כדי שנוכל לתפוס את הפינצטה שבה אנו משתמשים. שוב, לא חדה מדי כדי שלא תפגע ברקמות, אך מספיק עדינה כדי שנוכל לבצע מניפולציות מבלי לכופף את הכלי. חשוב מאוד להשתמש בכלים נקיים, ולכן אנו מנקים אותם באופן קבוע לאורך הפרוצדורה באמצעות פינצטה סגורה.
הפרידו את שתי השחלות על ידי הסרת רקמת החיבור בקצה האחורי. בקצה האחורי נמצאים תאי הביצים הבשליים ביותר. הניחו שחלה אחת במצב אופקי, כאשר תאי הביצים הצעירים ביותר פונים לכיוון ידכם הדומיננטית.
לאחר מכן, אחזו בעדינות את הקצה האחורי באמצעות רקמת החיבור שנותרה, והשתמשו במוט ניתוח (dissecting probe) או במחט טונגסטן כדי להפריד את תאי הביצים הבודדים; תאי ביצים משלב Jamar ועד שלב 10 יופרדו זה מזה, אך תאי ביצים ישנים יותר יישארו מחוברים לשחלה. בעזרת המוט, גררו בזהירות 15 עד 25 תאי ביצים שהופרדו אל מרכז טיפת השמן. אם יש צורך להפריד יותר משחלה אחת, בחרו שחלה מזבב אחר.
השליכו כל רקמה שסחיתית משרי השחלה ועבדו במהירות, שכן התאים יתחילו להראות שינויים פנוטיפיים עקב סטרס. לאחר 40 דקות מההפרדה מהשחלה, הסירו את עודפי רקמת השחלה מהשמן. להזרקת תאים בשלב ביניים, בעזרת מכשירים נקיים, הכו את האריאלים במצב ניצב לציר האורכי של זכוכית הכיסוי. כדי לבודד תאי ביצה בשלב מאוחר.
נדרשת שיטה שונה כאשר תופסים את החלק האחורי של השחלה כפי שתואר קודם לכן. הכניסו את probes הדיסקציה אל הקצה האחורי של השחלה בקרבת הפינצטה. כדי למנוע פקיעה של תאי הביצים, הכניסו את ה-probe בין תאי ביצים בשלבים מאוחרים של התפתחות.
משכו את מחט הניתוח דרך השחלה עד שהיא יוצאת דרך תאי הביצים בשלב מוקדם. כאשר הפעולה מבוצעת נכון, הפרובה תסיר את רקמת החיבור המחזיקה את ה-aerials ואת תאי הביצים בשלב מאוחר במקומם. חזרו על שלב זה עד שה-aerials יפרוסו על גבי זכוכית המכסה.
השלב מסתיים כאשר תאי הביצים אינם נערמים עוד זה על גבי זה. בעזרת מחט דיסקציה, הפרדו את תאי הביצים בשלבים המאוחרים כדי להקל על הדמיית שלב 14. השתמשו בפינצטה כדי לתפוס את התגים הגביים של תאי הצוואר.
הכינו את התמיסות להזרקה על ידי צנטריפוגה קצרה במהירות גבוהה. פעולה זו תשקיע משקעים מוצקים שעלולים לחסום את מחט ההזרקה. לאחר מכן, טענו את מחט ההזרקה באמצעות טיפ טעינה וחברו בזהירות את מחט ההזרקה הטעונה למזרק ההזרקה.
כעת הניחו פיסת זכוכית קטנה בסמיכות לדגימות והניחו את השקופית על במה של המיקרוסקופ. הזכוכית תשמש כקיר למניעת זליגה או כדי לעצור את התהליך. נתקו את המחט.
הכינו את המיקרוסקופ ואת מכשיר ההזרקה עבור הניסוי. יש להישמר כדי לא לשבור את קצה המחט. במידת האפשר, השתמשו בבמה אוטומטית בעלת יכולת ביקור בנקודות (point visiting capability) כדי לסמן את כל התאים בשלב שמונה ובשלב תשע להזרקה.
כעת, הורד את מחט ההזרקה עד שתיגע בשמן. בחר את הנקודה הראשונה מרשימת הנקודות המסומנות ומקד את המבט על התא. הורד את המחט ידנית עד שתהיה באותו מישור מיקוד של התא.
בעזרת בקרי המניפולטור, הזז את קצה מחט ההזרקה עד שתהיה בתוך אתר ה-U. תנועת דקירה מהירה היא לרוב מוצלחת יותר מתנועה איטית. לאחר החדירה, הזרק נפח קטן מהמחט והערך חזותית את ההשפעות.
נדרשת חזרה על הפעולה. אם ההזרקה הצליחה, הציטופלזמה בתוך התא תודחק. קשה לכמת את הכמות המדויקת של הנוזל שהוזרקה.
כדי להגדיל את הנפח המוזרק, יש להתאים את הלחץ או את משך פעימת ההזרקה. ניתן לשבור את קצה המחט כדי להרחיב מעט את פתח המחט, או פשוט להשתמש במספר פעימות הזרקה לפני בחירת ה-mark.Cyte הבא. הרם את מחט ההזרקה מספיק גבוה בשמן כך שלא תתנגש ב-cytes אחרים.
דקירות מרובות או השהייה ממושכת של המחט בתוך התא גורמות לנזק חמור לתא הביצה. לכן, יש לפעול במהירות. ההזרקה צריכה להימשך פחות מ-10 שניות.
במידה ונעשתה טעות, עברו לסימון הבא באתר. אין לבזבז זמן על אתר פגום. כאשר המחט נסתמת, העבירו את המחט לחתיכת זכוכית שבורה.
כאשר הזכוכית והמחט נמצאות באותו מישור מוקד, הכניסו בעדינות את המחט אל תוך הזכוכית. בדקו שהמחט אינה סתומה על ידי לחיצה על כפתור ההזרקה ובדיקה אם נוזל יוצא מקצה המחט. לאחר שהוזרקו כל אתרי ה-US, הוציאו ידנית את המחט מהשמן והסיטו אותה אל מחוץ לנתיב הקרן של המיקרוסקופ.
יש לוודא שהמכשיר נמצא בכיוון בטוח כדי למנוע נזק לעיניים, ושהאורות כבוים. כדי להקל על הדמיה פלואורסצנטית, המהירות היא גורם מכריע. אם חלפה שעה או יותר בין בידוד תאי השחלה (egg chamber) להזרקה לתאים, יהיה קשה להזריק לתאים והם יציגו שינויים פנוטיפיים הקשורים למצבי דחק.
בעיות דומות עלולות להיווצר כתוצאה מטיפול גס בתא או מהזרקה של נפחים עודפים. ניתן לדגם תאי ביצים המבטאים חלבונים פלואורסצנטיים טרנזגניים ללא צורך בהזרקה. ניתן לדגם סימוני MS two של RNA אנדוגני בתוצאות טובות תוך שימוש בנהלי בידוד רקמה באמצעות הפרוטוקול המלא המסונתז in vitro.
RNA מסומן ב-Alexa 546 הוזרק לתוך לשכת ביצית של זבוב מסוג ME 31 BGFP; ה-RNA התמקם בחלק הקדמי-גבי של הציטופלזמה ויצר כיסה מסביב לגרעין ברגע שהתהליך הושלם. טכניקה זו ניתנת לביצוע תוך כ-10 דקות מרגע הניתוח ועד לתחילת הדמיה. בעת ביצוע פרוצדורה זו, יש לשמור על הרקמה על ידי עבודה מהירה אך זהירה. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה בידיכם הבנה טובה של האופן שבו ניתן להקליט תהליכים דינמיים בתאי Drosophila חיים.
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול לניתוח והדמיה של תאי ביצים חיים של Drosophila לצורך חקר לוקליזציה של mRNA. השיטה שמה דגש על הדמיה מהירה ברזולוציה גבוהה כדי ללכוד תהליכים דינמיים ברקמה חיה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- ביולוגיה התפתחותית
רקע
- חדרי ביצים של דרוזופילה (Drosophila) משמשים כמודל למחקרים על מיקום mRNA.
- הבנת הובלת RNA ותרגום מקומי היא קריטית לביולוגיה של ההתפתחות.
- טכניקות דימוי ברזולוציה גבוהה הן חיוניות לצפייה בתהליכים תאיים דינמיים.
- נדרשת מומחיות טכנית לצורך ביצוע מוצלח של הניתוח והדימוי.
מטרת המחקר
- להקלטה של תהליכים דינמיים בתאי ביצים חיים של Drosophila.
- לבדיקת הבקרה על ביטוי חלבונים בזמן ובמרחב.
- להעמקת ההבנה של אינטראקציות בין רכיבים תוך-תאיים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בידוד שחלות מנקבות Drosophila.
- דיסקציה של תאי ביצה בודדים לצורך דימוי.
- הזרקה מיקרוסקופית של סמנים פלואורסצנטיים לתאי ביצה.
- דימוי ברזולוציה גבוהה לניתוח תהליכים דינמיים.
תוצאות עיקריות
- דימות מוצלח של תאי ביצית (egg chambers) חושף אינטראקציות של רכיבים תוך-תאיים.
- הודגמה חשיבותן של המהירות והמיומנות בתהליך הדיסקציה.
- סופקו תובנות לגבי הבקרה של חלבוני תכנית הגוף (body plan proteins).
- הודגשו האתגרים העומדים בפני המתנסים הראשונים בטכניקה.
מסקנות
- הפרוטוקול מאפשר מחקר יעיל של לוקליזציית mRNA ברקמות חיות.
- הדגמות חזותיות הן קריטיות להעברת מניפולציות מורכבות.
- שיפור מתמיד של הטכניקות ישפר את תוצאות הניסוי.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
דימות חי של תאי ביצים בודדים של Drosophila מאפשר תצפית ישירה על תהליכים תוך-תאיים דינמיים, התומכת בהפחתת סיכונים מכניסטיים בשלבי הגילוי המוקדמים. פרוטוקול ההכנה זה מבטיח רלוונטיות פיזיולוגית וחיוניות של הרקמה, שהם קריטיים ליצירת נתונים כמותיים וניבויים במסלולי עבודה של ביולוגיה של התפתחות וביולוגיה של התא. השיטה תומכת ברציפות תרגומית על ידי אספקת פלטפורמה חסונה לחקר לוקליזציה של mRNA ודינמיקה של ביטוי חלבונים במערכת הרלוונטית למחלה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בדיקה בזמן אמת של מנגנוני הובלת RNA ותרגום מקומי.
- תומך בתיקוף תפקודי של מבנים גנטיים ומרכיבי מסלולים במערכת חיה.
- מסייע בהסרת סיכונים מכניסטיים על ידי ויזואליזציה של דינמיקת חלבונים ו-mRNA in situ.
- מספק פלטפורמה למחקרים מונחי-השערה על קביעת צירים ואורגנוגנזה.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מכין דגימות רלוונטיות פיזיולוגית עבור בדיקות דימות בעלות תוכן גבוה (high-content imaging assays).
- מבטיח הדירות וסטנדרטיזציה בזרימות עבודה של דימוי תאים חיים.
- תומך בניתוח כמותי של מולקולות ומבנים תאיים המסומנים פלואורסצנטית.
- מאפשר הערכה מהימנה של הפרעות גנטיות או כימיות בסביבה מבוקרת.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- עולה בקנה אחד עם מודלים רלוונטיים למחלה לצורך חקר תהליכים התפתחותיים ודיפרנציאציה תאית.
- מספק רציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני של מטרות מולקולריות.
- מאפשר קידום מותאם סיכונים באמצעות חשיפת ההשלכות הפנוטיפיות של מניפולציה גנטית.
- תומך בזיהוי של סמנים ביולוגיים תרגומיים באמצעות פלטי דימות חיים.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
פרוטוקול זה משתלב בממשק שבין שלבי הגילוי המוקדמים לפיתוח בדיקות (assays), ובכך מאפשר סריקות המשך ומחקר תרגומי. הוא מיועד לתמוך בזרימות עבודה החל מבדיקת השערות ועד לתיקוף של מודלים פרה-קליניים.
- ביולוגיית גילוי: מאפשר בדיקת היפותזות לגבי לוקליזציה של RNA וביטוי חלבונים ברקמה חיה.
- סריקה: מספקת דגימות חיוניות וסטנדרטיות עבור בדיקות דימות כמותיות.
- אנליטיקה: מספקת מדדים כמותיים ודינמיים להשוואה בין תנאים ניסיוניים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין ממצאי גילוי למודלים פרה-קליניים על ידי שמירה על רלוונטיות פיזיולוגית.
- שימוש חוזר ארגוני: מקים פלטפורמה לשימוש חוזר עבור מחקרים גנטיים ומולקולריים מגוונים ב- Drosophila.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף מטרות.
- ערך תפעולי: מקדם סטנדרטיזציה, הדירות ויכולת הרחבה בתהליכי עבודה של דימיון חי.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של המשך או הפסקת פיתוח (go/no-go) ויעילות הון באמצעות מתן אפשרות להפקה של נתונים כמותיים חסונים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם סיכונים ובקידום נכסים בשלב הגילוי.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות טכנית בניתוח רקמה חיה ובהזרקה מיקרוסקופית.
- דורש גישה למערכות דימות ברזולוציה גבוהה ולכלי מיקרו-מניפולציה מדויקים.
- מחייב סטנדרטיזציה קפדנית בין צוותים כדי להבטיח הדירות.
- עשוי לדרוש התאמה לשלבי התפתחות שונים או לרקעים גנטיים שונים.
- רגישות לזמן וחיוניות הרקמה הן מגבלות קריטיות להצלחה ניסיונית.
