רובוטיקה ניתוח תמונה דינאמית ללימודים של ביטוי גנים ברקמות הצמח

בנוהל זה, נדמיינים לאורך זמן הדינמיקה של ביטוי גנים ברקמות צמחים באמצעות רובוטיקה; ראשית, זרעי פסוליה מסטריליים ומונחים בין מגבות נייר לחות בתוך כלי לתרבית רקמה לצורך הנבטה. לאחר ארבעה ימים, הקטנינים מוסרים ומופצצים עם מבנה DNA המכיל פרומוסר המחובר ל-GFP. הקטנינים מונחים בצלחות פטרי המורכבות על מערכת רובוטית דו-ממדית למשמורת תמונות שתוכננה במיוחד. הרובוט מתוכנת ללכוד תמונות של כל פיסת רקמה בכל שעה במשך 100 שעות.

התמונות עוברות ניתוח תמונה, המניב נתונים כמותיים על עוצמת ביטוי ה-GFP לאורך זמן. שלום, אני ג'ון פיינר, מנהל מעבדת התרבות של צמחים במחלקה להורטיקולטורה ומדעי היבולים באוניברסיטת אוהיו הממלכתית. אני קרלוס הרננדז גרסיה, סטודנט לדוקטורט במעבדה באוניברסיטת אוהיו הממלכתית.

היום קרלוס יציג בפניכם את הפרוטוקול שפיתחנו לניתוח ביטוי גנים ברקמות צמחים באמצעות חלבון פלואורסצנטי ירוק. אנו משתמשים בהליך שפיתחנו במעבדה למדידת פעילות של OD. לשם כך, הקידומת של פרומוטר זה ממוקמת במעלה (upstream) של הגן GFP, המשמש כגן הדגש שלנו.

אני אראה לכם כיצד אנו מחדירים את בקרת הפרומוטור לתוך העורקים של פולי לימה (Lima bean) ומבצעים דגימה באמצעות מערכת לכידת תמונות רובוטית בעיצוב מותאם אישית. אסיים בסקירה של הפרוטוקול שלנו לניתוח תמונות. כדי להתחיל בהליך זה, עטרו את זרעי פולי הלימה בסטריליזציה של השטח באמצעות נהלים סטנדרטיים.

הניחו את הגרעינים הסטריליים במיכלים מסוג magenta GA seven בין שכבות של נייר סופג לח, והדגירו אותם למשך ארבעה ימים בטמפרטורה של 25 degrees Celsius. כאן אנו משתמשים בוקטור ביטוי בעל מספר עותקים גבוה, המועיל לניתוחים של פרומוטורים ואלמנטים של פרומוטורים. וקטור זה מכיל את הגן GFP, המשמש להדמיית התפקוד של פרומוטור או אלמנט פרומוטור ברקמות שעברו טרנספורמציה כשעה עד שעתיים לפני ההפצצה.

הוצאו את ה-CU leadin של פולי לימה מקליפות הזרעים. ה-CU leadin המתאים להפגזה צריך להיות בצבע צהוב עד ירוק בהיר, שטוח וללא נזקים שעלולים להפריע לניתוח תמונות בהמשך; מיד לאחר ההוצאה, הניחו 12 CU leadin בצלחית פטרי עם מצע תרבית OMS המכיל מלחים של MS, ויטמין B5, 3% sucrose ו-0.2% gel rate ב-pH 5.7. לאחר מכן, השקיעו את מבנה ה-DNA על חלקיקי טונגסטן M 10. ראשית, רגע לפני השימוש, השביחו את החלקיקים במים סטריליים לריכוז של 100 mg/mL.

לאחר מכן, בתוך מבחנת צנטריפוגה של 0.6 מיליליטר, יש להוסיף 25 µL של חלקיקים, 5 µL של DNA בריכוז של 1 µg/µL, 25 µL של סידום כלוריד 2.5 M ו-10 µL של ספרמין 100 mM. יש להדגיר את תמיסת ה-DNA על קרח למשך חמש דקות, ולאחר מכן להסיר ולהשליך 50 µL מהתמיסה שנמצאת מעל החלקיקים. יש להחזיר למצב של סספנזיה את החלקיקים המצופים ב-DNA שנותרו בתחתית המבחנה באמצעות וורטקס.

מיד לאחר הערבוב בוורטקס, הוצא שני מיקרוליטר Eloqua. חזור על שלב הערבוב בוורטקס. בכל פעם שמוצא Eloqua, יש לשמור את החלקיקים המצופים על קרח ולהשתמש בהם תוך 15 דקות.

כעת, לאחר שה-DNA קשור לחלקיקים, העבירו 2 µL של חלקיקים דרך החלק העליון של מסנן מזרקה למרכזו של מסך סינון. לאחר מכן, מקמו את מסנן המזרקה ביחידת החזקת המסנן בתוך תא הזרמת החלקיקים (PIG). הניחו פוליאודה (lima bean co leadin) כאשר הצד האקסיאלי פונה כלפי מעלה על מחיצה המורכבת ממסך המותח למסוף של כלי ביקר.

מקם את המחיצה, המשמשת כפלטפורמה לתמיכה ברקמות במהלך ההפצצה בתא של תותח החלקיקים. כדי להפציץ את הרקמה, פתח תחילה את השסתום המוביל לוואקום כדי לרוקן את התא. כאשר הוואקום מגיע ל-760 millimeters of mercury, הפעל את הסולנואיד ושחרר את ההליום כדי להניע את החלקיקים.

לחץ ההליום המשמש להאצת החלקיקים הוא 50 עד 60 PSI. לאחר הפצצת החלקיקים, סגרו את שסתום קו הוואקום ושחררו את הוואקום באמצעות שסתום הפליטה. כאשר הוואקום משוחרר, פתחו את דלת התא כדי להוציא את ה-co leadin שהופצץ ולהחזיר את ה-co leadin לצד ה-dal.

העבר למצע גידול OMS לצורך כימות ופרופיל ביטוי. בצע הפגזה לפחות לשלושה דגימות עבור כל מבנה DNA. נכללה גם ביקורת חיובית, המספקת פרופיל ביטוי של גן שנחקר היטב.

הדגימות מוכנות כעת לדימוג. הדלק את מנורת הכספית והמתן 30 דקות עד לחימום המנורה. הדלק את מקורות המתח עבור מצלמת ה-SPOT R-T-C-C-D ובקר המנוע, המניע את תנועת פלטפורמת הרובוטיקה בעיצוב מותאם, המחזיקה שמונה פלטות.

הגדירו את מערכת המסננים לזיהוי GFP על ידי בחירת מערכת המסננים GFP two בעלת עירור של 480 nanometers ופליטה של 510 nanometers במיקרוסקופ סטריאוסקופי MZ L three. לאחר מכן, סטריליזרו את מכסי פטרי ב policarbonate מעובה על ידי התזה של 70% ethanol. המכסים המיוחדים המשמשים לכיסוי בסיס פטרי הדיש מונעים התעבות במהלך איסוף התמונות.

הנח את הצלחות המכילות את ה-cuan שהופצץ על פלטפורמת הרובוטיקה והדק את בורג השבייה הצדי כדי לקבע אותן במקומן. כעת פתח את יישום התוכנה המותאם אישית השולט הן בפלטפורמת הרובוטיקה והן ברכישת התמונות. פתח באמצעות התוכנה גם את מתג בקרת האור הלבן, והנח את הפלטפורמה לעמדת הבית.

פעולה זו מבוצעת לפני הגדרת המיקומים. עבור כל מנחה (coddle leadin) בלשונית המנוע (motor tab), יש לבחור בלוח הראשון. הפלטפורמה תמקם את מרכז צלחת הפטרי מתחת לעדשה של המיקרוסקופ.

השתמשו בכפתורי מרחק התזוזה כדי למקם במדויק את ה-CU LEADIN הראשון לצורך איסוף תמונות. באמצעות תכונת מצב התצוגה החיה (live mode), העבירו את ה-cuddle leaden לאזור הצפייה המתאים. עבור ה-cuddle leaden הראשון, השתמשו במפתחות הידניות של מיקרוסקופ הדיסקציה כדי לכוון את הפוקוס והגדירו הגדלה של 1.6 x. לאחר שנקבע האזור המבוקש, לחצו על כפתור הוספת מיקום זה (add this position).

התוכנה תוסיף את הקואורדינטות של אזור זה לקובץ לוח המיקומים, והפלטפורמה תחזור למרכז הלוח שנקבע עבור כל שאר ה-coens שעל הלוחות. בעזרת כפתורי מרחק התזוזה, השתמשו בשלושת ברגי הפילוס הידניים הממוקמים מתחת לכל לוח על פלטפורמת הרובוטיקה כדי לכוון את הפוקוס עבור שאר ה-coan באותו לוח. לאחר שהוזנו כל הקואורדינטות של כל ה-coan, שמרו את קואורדינטות לוח המיקומים.

הזינו את פרמטרי איסוף התמונות, כגון סוג האור, שהוא כחול עבור GFP, ואת הגדרת החשיפה, וכן הגדירו את מיקום אחסון התמונות כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב המצורף. עברו ללשונית בקרת זמן הלכידה והגדירו את מרווח הזמן לרכישת התמונות ואת המספר הכולל של מחזורי איסוף התמונות. בדרך כלל נאספות תמונות מדי שעה למשך 100 שעות.

יצירת פרופילי ביטוי גנים מוגדרים היטב. התחילו את רכישת התמונות על ידי פתיחת לשונית לוח הזמנים של המיקומים ולאחר מכן לחיצה על כפתור הרצת לוח הזמנים. בדלו את מערכת איסוף התמונות מאור חיצוני בסיום איסוף התמונות שנמשך 100 שעות.

התמונות ברזולוציה גבוהה, שגודלן כחמישה מגה-בייט כל אחת, מוכנות לניתוח תמונה. השתמש ב-Image Ready כדי להרכיב את 100 התמונות הרצופות מכל תיקייה. ייבא את כל התמונות הרצופות כפריימים ושנה את גודלן ל-800 על 600 פיקסלים כדי להאיץ את עיבוד התמונה.

בשלב הבא, השתמש בסימונים בשכבה חדשה שהוכנסה, הגלויה בכל הפריימים, תוך שימוש בנקודות GFP נבחרות כייחוס לתמונה. יישר ידנית כל תמונה, וכאשר היישור יושלם, מחק את השכבה ששימשה כייחוס ושמור את הקובץ כקובץ PSD יחיד. כמו כן, ייצא את כל הפריימים כקובץ MOV יחיד ברזולוציה הגבוהה ביותר.

הקבצים מוכנים כעת לתחילת הכמות של GFP. השתמש ב-Image J כדי לפתוח את קובץ ה-MOV וגזור שטח של 400 על 300 פיקסלים. לאחר מכן, הפרד את התמונות הרצופות לערוצים אדום, כחול וירוק באמצעות כלי ה-RGB split עבור הערוצים האדום והירוק.

חסרו את הפלואורסצנציית הרקע באמצעות כלי התוסף subtract measured ROI for each slice. חשבו את ביטוי ה-GFP על ידי התאמת רמות הסף ושימוש בתוסף המיועד למדידת ערך גוון האפור הממוצע (mean gray scale value) לכל פיקסל ומספר הפיקסלים הכולל המבטאים GFP. העתיקו את ערכי הפלט ב-ImageJ. לבסוף, הדביקו את ערכי הפלט עבור הערוצים הירוק והאדום ל-Microsoft Office.

תוכנת Excel לעיבוד נתונים נוסף כדי לתת לך מושג על תוצאות יישור התמונות. אנימציה ראשונה זו מראה את חוסר הדיוק במיקום מחדש של פלטפורמת הרובוטיקה במהלך הניסוי שנמשך 100 שעות. תנועת הנקודות היא תוצר לוואי (artifact) הנובע מחוסר יכולתה של פלטפורמת הרובוטיקה לחזור בדיוק לאותו מיקום בכל נקודת זמן; לאחר יישור תמונות ידני, ניתן להבחין בקלות בתאים המבטאים GFP, והמאפיינים הייחודיים של מערכת מעקב זו מוצגים באופן ויזואלי וברור.

בעוד האנימציה חוזרת, שימו לב לתאי ה-GFP המעגלים; התא המעוגל באדום מראה ירידה מהירה מאוד בביטוי בין 18 ל-20 שעות לאחר ההפצצה, בעוד שהתא המעוגל בלבן מראה התחלה מושהית של ביטוי GFP. מלבד האנימציות, הליך זה מאפשר כימות מהיר של ביטוי GFP לאורך זמן ברקמת המטרה של פול לימה. תוצאות מייצגות אלו מראות כימות השוואתי של עוצמת מקדם תוך שימוש במקדם CAMV 35 S וארבעה מקדמים שונים של פולי סויה.

הראינו לכם כיצד להחדיר DNA לתוך הקטלון של נבט. זרעי הפסוליה מהסוג Lima vein מניחים את הקטלון על הרובוט, אוספים תמונות לצורך ניתוח תמונה ומנתחים תמונות אלו. אנו משתמשים בפרוצדורה זו באופן שגרתי במעבדתנו לצורך תיקוף של פרומוטורים של צמחים משובטים.

ניתן להפיק כמות גדולה של נתונים באמצעות החדרה של מקרימי צמחים שונים. עם זאת, הליך זה הוא מורכב וכולל שלבים רבים שעלולים להשתבש; בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב להתחיל עם זרעי שעועית טריים או לפחות להשתמש בזרעים באיכות גבוהה שאוחסנו כראוי. כמו כן, חשוב להשיג את המכסה החתוך להפצצה, להתקינו על הרובוט במהירות ולהשתמש במכסה צלחת פטרי עבה כדי למזער בעיות של עיבוי.

ולסיום, שימו לב כי ה-GFP שבו אנו משתמשים הוא גרסה אחרת הנקראת SGFP, ממעבדת Gen HIN באוניברסיטת הרווארד. GFP זה אינו יציב במיוחד ועשוי להיות מתאים יותר למעקב אחר שינויים מהירים בביטוי גנים. וזהו, תודה שצפיתם בנו.

ובהצלחה בניסוייכם.