ניתוח ספציפי של תא

המטרה הכללית של הליך זה היא לבודד אוכלוסייה של פרוטופלסטים ספציפיים לסוג תא מסוים מעלה. הדבר מושג תחילה על ידי גידול צמחים המבטאים GFP בסוגי תאים ספציפיים בעלה. השלב השני הוא קצירת עלים ויצירת פרוטופלסטים באמצעות עיכול אנזימטי.

בשלב הבא, הפרוטופלסטים מסוננים וממוינים באמצעות מיון תאים מופעל פלואורסצנציה (fluorescence activated cell sorting) או FACS. השלב האחרון הוא אישור דיוק המיון באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. בסופו של דבר, ניתן להשתמש בפרוטופלסטים הממוינים לניתוח ביטוי גנים ספציפי לסוג התא, ניתוח פרוטאומי או פרופיל מטבולי.

מיון תאים מופעל פלואורסצנציה (Fluorescent activated cell sorting) שימש בעבר בהצלחה עבור שורשים, אך כעת הוא משמש לבידוד תאי עלה. סימון באמצעות GFP לפני שיטה זו היה מוגבל בשל הפרעות מפלואורסצנציה של כלורופיל. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן הכנת דגימות מהירה אך זהירה היא חיונית לצמצום שינויים פיזיולוגיים נרחבים שעלולים להתרחש במהלך מיון התאים.

באופן כללי, אנשים שאינם בקיאים בשיטה זו יתקשו בביצועה מכיוון שלא יהיו מודעים לאופן הגדרת ממיין התאים או לאופן אישור דיוק המיון. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובה לשאלות מפתח בתחום הביולוגיה של מערכות הצמחים. הבעיה בזיהוי רשתות ויסות גנים באיברים רב-תאיים מורכבים, כגון עלה, היא שסוגי תאים שונים מבטאים קבוצות שונות של גנים.

מידע גנטי זה הולך לאיבוד בניתוח איסוף של עלה שלם המדגים את הפרוצדורה. לצדי יהיו Ellison As ו-Sanjeev Kuma, המספקים תמיכה טכנית לעבודה זו במעבדה שלנו. ראשית, מלאו צלחת פטרי עגולה בקוטר תשעה סנטימטרים ב-20 milliliters של תמיסה A המכילה אנזימי proto plating ומעכבי transcriptional ו-RNAs.

לאחר מכן, אספו את חומר העלה הרצוי עבור דגימות המכילות יותר מעלה אחת, בדומה לדגימה המוצגת כאן. סדרו את העלים בערימה של עד 15 עלים. לאחר מכן, השתמשו בלהב תער כדי לחתוך את העלים לרצועות ברוחב של 1 millimeter.

העבירו מיד את רצועות העלים אל צלחת הפטרי באמצעות פינצטה שטוחה, הפרידו בעדינות בין הרצועות ובצעו חלחול בוואקום (vacuum infiltrate) לדגימות פעמיים, למשך חמש דקות בכל פעם. לאחר מכן, הניחו את צלחת הפטרי על מנער אורביטלי המכוון ל-90 RPM בטמפרטורת החדר והספיגו את דגימות הפרוטופלסט למשך שלוש עד ארבע שעות. במהלך האינקובציה, השתמשו בפינצטה כדי להפריד בין רצועות העלים במרווחי זמן של חצי שעה.

לאחר העיכול, סננו בעדינות את תמיסת הפרוטופלסטים דרך מסננת תאים של 70 מיקרון לתוך מבחנה של 50 מיליליטר. רצועות העלה יישארו במסננת לצורך הסרתן, בעוד הפרוטופלסטים יעברו דרכה.

כעת השתמש בארבעה מיליליטר של תמיסה A כדי לשטוף בעדינות את רצועות העלה, תוך איסוף מי השטיפה לשפופרת של 50 מיליליטר. לאחר מכן, העבר את תרחיף הפרוטופלסטים לשפופרות בעלות תחתית עגולה וסבב את הפרוטופלסטים בצנטריפוגה למשך חמש דקות במהירות של 300 ×g ובטמפרטורת החדר. תוך הקפדה שלא להפר את המשקע, שאב בעדינות כמה שיותר מהנוזל העליון (supernatant), ולאחר מכן שטוף את הפרוטופלסטים עם חמישה מיליליטר של תמיסה A תחת אותם תנאי סבב בצנטריפוגה.

לבסוף, לאחר הסרת השכבה העליונה הצפה, השתמשו בטיפ P 1000 קטום כדי לערבב מחדש את ה-PROTOPLASTS בנפח מתאים של תמיסה A לפני המיון באופן מיידי. השתמשו בטיפ P 1000 לא קטום כדי לפרק גושים בתמיסת ה-Protoplasts. בצעו דיסוציאציה נוספת של התאים על ידי סינון ה-protoplasts לתוך מבחנה למיונים דרך מסנן fillon של 50 micron.

לאחר מכן, דללו את תמיסת התאים כראוי כדי למנוע סתימה של פיית שאיבת התאים. לאחר קביעת תנאי שאיבת התאים האופטימליים, זהו את ה-Proto plus החיוביים ל-GFP באמצעות לייזר Argonne של 488 nanometer, תוך השוואת הפלט ממסנן Band pass 580/30 לעומת מסנן Band pass 530/40. שימו לב כי הפרוטופלסטים החיוביים ל-GFP יופיעו באוכלוסייה בעלת ערכי 530 גבוהים ו-580 נמוכים.

במקרה של פרוטופלסטים שאינם מביעים GFP באוכלוסיית low 530, low 580, הפרוטופלסטים המתים או הגוססים והשברים מופיעים באוכלוסיית high 580; לצורך הדמיה של הפרוטופלסטים הממוינים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, מיינים את הפרוטופלסטים ישירות לתוך שמונה נפחים לפחות של תמיסה A, ולאחר המיון מרכזים את הפרוטופלסטים באמצעות סבוב (centrifugation). ניתן למיין את הפרוטופלסטים לתוך שמונה נפחים של תמיסה A ולאסוף אותם להדמיה במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לאמת את ההעשרה. תמונה ראשונה זו מציגה דוגמה להעשרה של השורה התאית TP 382, המבטאת GFP בתאי השמירה. דוגמאות לתשואות שהושגו בשיטה זו, הן לפני והן אחרי הגברה, מסוכמות בטבלה זו.

הכמויות שהתקבלו, שנעו בין 500 picograms ל-50 nanograms, מספיקות להגברה באמצעות מערכת ovation PICO WTA ולניתוח עוקב באמצעות quantitative PCR, next generation sequencing או microarray. סדרת התמונות הבאה מציגה קווי תאים שונים של פרוטופלסטים שבודדו ומוינו לפי השיטה שתוארה לעיל. הפרוטופלסטים הראשונים הופקו מ-KC 2 74, עלים, חתך רוחבי של KC 2 74.

העלה מראה כי ה-GFP מבוטא במערכת הכליים. פרוטופלסטים אלו בודדו מעלי KC 4 64, וחתך רוחב של עלה KC 4 64 מראה כי ביטוי של GFP נמצא באפידרמיס של A dal. לבסוף, פרוטופלסטים אלו הופקו מעלי TP 3 82 בעלי TP 3 82.

כאן מבוטא ה-GFP בתאי השמירה. מוצגים תרשימי פיזור (dot plots) טיפוסיים של רכישת נתונים ב-FACS, הממחישים את הפלט ממסנני פס-מעבר של 580 ± 30 ננומטר לעומת 530 ± 40 ננומטר. שערי המיון המוצגים הם אלו המשמשים בדרך כלל במהלך המיון.

תרשים פיזור ראשון זה של פרוטופלסטים שהופקו מעלי col4 אשר עברו פרוטופלסטציה בהיעדר מעכבים, מראה אוכלוסייה אחת של 530 נמוך, 580 נמוך. לעומת זאת, תרשים פיזור זה של פרוטופלסטים מסוג wild type שהופקו מעלי col4 אשר עברו פרוטופלסטציה בנוכחות מעכבים, מדגים את ההסטה בفلורסצנציית ה-580 המתרחשת עקב העקה והצביעה שנגרמו על ידי המעכבים. תרשמי פיזור אלו הם של פרוטופלסטים שהופקו מעלים מהקווי KC 74, KC 4 64 ו-TP 3 82, בהתאמה.

דגימות אלו עוברו גם בנוכחות מעכבים, מה שהראה כי ה-GFP נמצא באוכלוסיות עם ערכים גבוהים של 530 ונמוכים של 580. עבור ניסוי quantitative PCR מייצג זה, השגנו תחילה דגימות עבור כל סוג של פראקציה. לאחר מכן, הדגימות הועשרו באמצעות מערכת ovation PICO WTA ו-quantitative PCR.

בוצעו בדיקות באמצעות פריימרים ספציפיים ל-GFP. הערכים המוצגים הם הערכים הגבוהים ביותר באדום והנמוכים ביותר בירוק; ערכים ממוצעים או ערכים בודדים המשתמשים ב-actin two כגן ייחוס מסומנים על ידי הפסים הצהובים האופקיים. התוצאות מהוות אימות מחדש של ההערכות האופטיות של תכולת ה-GFP בתאים בפרקציות הממוינות.

האוכלוסייה בעלת ערכי high 530 low 580 הראתה את הרמות הגבוהות ביותר של ביטוי GFP שניתן למדוד. בעוד שהאוכלוסייה בעלת ערכי high 530 high 580 הראתה ביטוי GFP נמוך פי כ-1000, האוכלוסיות בעלות ערכי low 530, low 580 ו-low 530 high 580 הראו רמות נמוכות של ביטוי GFP שהיו דומות לאלו של קבוצת הביקורת של עלה שלם ואוכלוסיות פרוטופלסטים לא ממוינות. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו תוך ארבע עד חמש שעות מהצמח ועד לאוכלוסיית תאים ממוינת, אם היא מבוצעת כראוי. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לנטר ללא הרף את ממייין התאים ולכייל אותו מחדש במידת הצורך כדי לשמור על דיוק המיון.

נוהל זה נמצא. ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון ניתוח microray, כדי להשוות ולבחון הבדלים ברמות הביטוי הגנים בסוגי תאים שונים. כעת, לאחר שטכניקה זו פותחה, אנו מנתחים ביטוי גנים בסוגי תאי עלה ספציפיים בשלבי התפתחות שונים, ונשווה זאת לנתונים מהעלה השלם שהופקו בפרויקט האגרונומיה.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לבודד סוגי תאים בודדים מעלים באמצעות מיון תאים מופעל פלואורסצנציה (fluorescence activated cell sorting).