ניתוח מקיף של ההלחנה קירות התא הצומח (ביומסה Lignocellulosic) חלק א: ליגנין

קביעת תכולת הליגנין והרכבו בדפנות תאי צמחים מתחילה בחומר צמחי מיובש, המועמד לסוגים שונים של מיצויים. החומר המתקבל מורכב מדפנות תאים בלבד, ולאחר מכן הוא מחולק כדי לקבוע את תכולת הליגנין. חומר הדופן עובר הידרוליזה באמצעות acetyl bromide, והמונומרים המומסים נמדדים באמצעות ספקטרומטריית UV לקביעת הרכב הליגנין.

חומר הדופן עובר הידרוליזה באמצעות ציטוליזה. רכיבי הליגנין המומסים מומרים לאחר מכן לנגזרות טרימטיל-סיליל נדיפות, אותן ניתן להפריד ולכמת באמצעות כרומטוגרפיית גזים בשילוב עם ספקטרומטריית מסות. קביעת הרכב הפוליסכרידים של המטריצה ותוכן התאית מודגמים בסרטון אחר תחת הכותרת Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls, part Two Carbohydrates.

שלום, אני מרקוס פאולי, ראש מתקן הניתוח של דפנות התאים במרכז המחקר לביו-אנרגיה של האגמים הגדולים כאן באוניברסיטת מישיגן סטייט. אני קליף פוסטר, מנהל מתקן הניתוח של דפנות התאים. נדגים לכם את הפרוצדורה לקביעת התוכן וההרכב של דגימות ביו-מסה של צמחים.

צמחים ממירים אנרגיית אור מהשמש לאנרגיה כימית כגון ביומסה. ביומסה של צמחים מורכבת בעיקר מדפנות תאים, רשת מורכבת של פולימרים מגוונים העוטפים את כל תאי הצמח. כאן אנו קובעים את הרכבם של חומרי דופן התא של הצמח כדי להעריך את הפוטנציאל להמרת lignin Cellose X, המהווים משאב מתחדש שכיח מאוד, לדלקים ביולוגיים.

היום נתמקד בליגנין פוליפנולי בסרטון נוסף שנקרא "ניתוח הרכב מקיף של דפנות תאי צמחים, חלק שני: פחמימות". נתמקד בניתוח הפוליסכרידים. כדי להתחיל בהליך זה, הוסיפו שלושה כדורי פלדה אל-חלודה בקוטר 5.5 מילימטר למבחנה עם פקק הברגה בנפח 2 מיליליטר וכ-60 עד 70 מיליגרם של חומר צמחי מיובש באוויר או בהקפאה.

ניתן לטחון את החומר לאבקה דקה באמצעות eyewall, רובוט לטחינה וחלוקה. ה-eyewall לוקח את המבחנה ומנער אותה במשך 30 שניות, במהלכן, בשל הכדורים המתכתיים, החומר נטחן לאבקה דקה; לאחר מכן, אבקת הצמח הטחונה אך הדחוסה משוחררת באמצעות הליך חלופי שאינו רובוטי ובעל תפוקה נמוכה. תהליך המקדם רטרו-בידוי מוצג בחלק השני: יש להוסיף לחומר הטחון 1.5 M של 70% aqueous ethanol, לבצע ערבוב ב-vortex ביסודיות ולסבב בצנטריפוגה בטמפרטורת החדר.

טיפול זה ממיס את רוב החלבונים ואת אברוני התא; שאבו את הנוזל העליון והוסיפו נפח שווה של תמיסת כלורופורם-מתנול למשקע שאינו מסיס באלכוהול. נערה היטב, סובבו מחדש את המשקע וסבבו בצנטריפוגה. הכלורופורם-מתנול ממיס תרכובות הידרופוביות כגון ליפידים; לאחר הסבוב בצנטריפוגה, שאבו את הנוזל העליון ותלו את המשקע ב-500 µL של אצטון.

כדי לייבש את הדגימה, יש לאדות את הממס באמצעות זרם אוויר בטמפרטורה של 35 degrees Celsius עד לייבוש מלא; ניתן לשמור את הדגימות המיובשות בטמפרטורת החדר עד לשלב העיבוד הבא. כדי להתחיל בהסרת העמילן משאריות הדגימה, יש להשהות את המשקע ב-1.5 mils של sodium acetate בריכוז 0.1 molar ב-pH 5, לסגור את המבחנות ולחמם אותן בבלוק חימום כדי לגרום לג'לטיניזציה של העמילן. לאחר קירור התוך על קרח, יש להוסיף את תערובת האנזימים לפירוק עמילן, לסגור את המבחנה ולערבל היטב במכשיר vortex, ולאחר מכן להדגיר את התוך למשך לילה.

במנער בטמפרטורה של 37 °C, מנער סיבובי מבטיח ערבוב תקין. לאחר דגירה לילה, יש להפסיק את העיכול על ידי חימום בבלוק חימום בטמפרטורה של 100 °C למשך 10 דקות. לאחר מכן יש לצנטריפוגה ולהשליך את עליון הנוזל (supernatant), המכיל עמילן מומס.

שטפו את המשקע שנותר שלוש פעמים באמצעות 1.5 mils של מים בכל פעם על ידי ערבוב ב-vortex, סנטריפוגה ושפיכה, כפי שהודגם קודם לכן. לבסוף, השביו את המשקע ב-500 microliters של acetone ואידו את הממס באמצעות זרם אוויר בטמפרטורה של 35 degrees Celsius עד לייבוש מלא. הדגימות המיובשות המכילות דפנות תאים מבודדות או רגליים, ללא celluloses, מוכנות לניתוח נוסף וניתן לאחסנן בטמפרטורת החדר.

התחילו בשקילה של 1 עד 1.5 מיליגרם של חומר דופן תא מוכן. ניתן לשקול את החומר באופן ידני או באופן אוטומטי באמצעות ה-eye wall כפי שהודגם בחלק השני. שטפו את דפנות המבחנה עם 250 microliters של אצטון כדי לאסוף את חומר דופן התא בתחתית המבחנה, ואדו את האצטון בעדינות רבה תחת זרימת אוויר.

לאחר שהאצטון התאדה, הוסף בעדינות 100 µL של acetyl bromide בריכוז 25% (נפח לנפח) שהוכן טרי, לאורך שני הדפנות של הכלי. כדי למנוע נתזים, הוסף את ה-bromide בזהירות; הוא מפרק את פולימר הליגנין למונומרים מאצטילים. לאחר מכן, סגור את הבקבוק הנפחי וחמם בטמפרטורה של 50 °C למשך שעתיים.

חממו שעה נוספת תוך כדי ערבוב כל 15 דקות, ובסוף קררו על קרח. לאחר קירור הבקבוק בטמפרטורת החדר, הוסיפו 400 µL של sodium hydroxide בריכוז 2 M ו-70 µL של hydroxylamine hydrochloride בריכוז 0.5 M שהוכן טרי; ערבבו את הבקבוקים הוולומטריים ב-vortex. לאחר מכן, נטרלו את התמיסה על ידי מילוי הבקבוק הוולומטרי בדיוק עד לסימון של 2 mL באמצעות glacial acetic acid; סגרו את הפקק והפכו את הבקבוק מספר פעמים לערבוב. העבירו באמצעות פיפטה 200 µL מהתמיסה המכילה את ה-mono lals שעברו הידרוליזה והמסה לתוך פלטת 96 בארות המיועדת ל-UV, וקראו את הפלטה באמצעות קורא פלטות ב-280 nm. קראו את הפלטה לפחות שלוש פעמים וחשבו את ממוצע הבליעה, שכן חלקיקים עלולים לגרום לשינוי קל בערכי הבליעה.

קבעו את אחוז הליגנין המסיס בברום עדין או A BSL באמצעות מקדם הצמח המתאים ובעזרת הנוסחה המוצגת בפרוטוקול הכתוב. ליגנין הוא רשת פוליפנולית המורכבת בעיקר משלוש תתי-יחידות: P hydroxy phenol, gua ACell ויחידות spring roll, וזאת כדי לקבוע את הרכב הליגנין בחומר הצמחי. התחילו בהעברה של כ-2 mg של חומר דופן תא אל מבחנה מזכוכית בעלת פקק הברגה לצורך ציטוליזה.

בשלב הבא, התכוננו להכין את תמיסות ה-2.5%boron tri fluoride ethyl ate וה-10%ethane thiol בתוך dioxane. מכיוון ש-dioxane מסוכן מאוד, אין להוציא דגימות או ציוד אל מחוץ למנדף. זכרו לעבוד בזהירות רבה ולהשתמש בבלון מלא בגז חנקן כדי להחליף את הנפח שאבד בבקבוק ה-dioxane בחנקן.

הכינו את התמיסה על ידי ערבוב הנפחים הבאים לכל דגימה: 175 µL dioxane, 20 µL ETSH ו-5 µL BF three. לאחר הערבוב, הוסיפו 200 µL מהתמיסה לכל דגימה. רססו את החלל העליון (headspace) של הבקבוק בגז חנקן וסגרו במכסה.

יש לחמם מיד את הדגימות בטמפרטורה של 100 °C למשך ארבע שעות, תוך ערבוב עדין מדי שעה. יש להפסיק את תגובת הליזיס על קרח למשך חמש דקות. לאחר מכן, יש להוסיף 150 µL של sodium bicarbonate בריכוז 0.4 M לצורך ניטרול ולערבב במערבל Vortex.

לניקוי תוצרי פירוק הליגנין, יש להוסיף 1 ml של מים ו-0.5 ml של אצטט, לערבב במכשיר וורטקס ולהמתין להפרדת הפאזות. שכבת האתיל אצטט תהיה למעלה ושכבת המים למטה. יש להעביר 150 µL משכבת האתיל אצטט העליונה המכילה את מרכיבי הליגנין למבחנה של 2 ml, תוך הקפדה שמים לא יעברו.

לאחר ההעברה משכבת ה-Ethyl acetate העליונה, יש לאדות את הממס באמצעות מרכז עם אוויר. הוסף 200 µL של אצטון ואדה אותו. חזור על הטיפול באצטון פעמיים כדי להסיר עודפי מים.

בשלב הבא, כדי להפוך את מרכיבי הליגנין לנגזרות trimethylsilyl נדיפות, הוסף לכל מבחנה 500 µL של ethyl acetate, 20 µL של purine ו-100 µL של N,O-bis(trimethylsilyl)acetamide. דגירה למשך שעתיים בטמפרטורה של 25 °C.

בסיום השעתיים, העבירו 100 µL מהתגובה לבקבוק GC MS והוסיפו 100 µL של אצטון. נתחו את הדגימות באמצעות GC המצויד בספקטרומטר מסות ארבע-קוטבי (quadrupole) או בגלאי יינון להבה (FID). לפרטים על העמודה ותנאי הריצה, אנא עיינו בפרוטוקול הכתוב המצורף.

להלן מספר תוצאות מייצגות של ניתוח הליגנין תוך שימוש בעץ צפצפה כחומר הצמחי. על פי ניתוח זה, 22% מחומר הצפצפה מורכב מליגנין פוליפנולי. הרכבם של מרכיבי הליגנין נותח באמצעות GCMS.

הפסגות מזוהות על ידי זמני שימור יחסיים באמצעות סטנדרט פנימי של tetra coane או על ידי ספקטרום מסים אופייני של 2 99 MZ, 2 69 MZ ו-2 39 MZ עבור המונימרים sg ו-h בהתאמה. הרכב רכיבי הליגנין נמדד על ידי הגדרת שטח הפסגה הכולל ל-100%. ניתוח ההרכב מראה שדגימה זו מכילה בעיקר יחידות string או S. עם זאת, גם יחידות Goya, aol או G נפוצות.

מובן כי הכמות וההרכב של היחידות המונומרים עשויים להשתנות בהתאם לרקמת הצמח ולמין. הרגע הצגנו כיצד לקבוע את תכולת הליגנין והרכבו של חומר צמחי לצורך ניתוח פוליסכרידים. עברו לחלק השני.

תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.