ניתוח מקיף של ההלחנה קירות התא הצומח (ביומסה Lignocellulosic) חלק II: פחמימות

קביעת הרכב הפוליסכרידים של המטריקס ותוכן התסلولוז הגבישי של דפנות תאי צמחים מתחילה בחומר צמחי מיובש, העובר סדרת מיצויים. החומר המתקבל מורכב מדפנות תאים בלבד, ולאחר מכן הוא מחולק כדי לקבוע את הרכב הפוליסכרידים של המטריקס. חומר הדופן מטופל בחומצה חלשה כדי להפליז פוליסכרידים שאינם גבישיים, שהם בעיקר ההמי-צלולוזות, לסוכרים הפשוטים (מונוסכרידים) שלהם.

לאחר מכן, המונוסכרידים מוחדרו לנגזרות של אלדול אצטטים נדיפים תואמים, אשר לאחר מכן נותחו וכמותם נקבעה באמצעות כרומטוגרפיה של גזים המצומדת לספקטרומטר מסות, לצורך קביעת תכולת התסلولוז הגבישי. דפנות התאים מטופלות בריאגנט גרף, תערובת של חומצות המסירות רכיבים שאינם גבישיים מדופן התא. התסلولוז הגבישי שנותר מפורק למונומר הגלוקוז שלו, שניתן לבחון אותו באופן קולורימטרי.

קביעת תכולת והרכב הליגנין מודגמת בפרסום וידאו אחר של JoVE תחת הכותרת Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls, part One Lignin. שלום, אני מרקוס פולי, ראש מתקן ניתוח דפנות התאים במרכז Great Lakes Bioenergy Research Center כאן באוניברסיטת מישיגן סטייט. אני קליף פוסטר, מנהל מתקן ניתוח דפנות התאים.

היום נראה לכם כיצד לקבוע את הרכב הפוליסכרידים הנוכחים בחומר דופן התא הצמחי, שהוא תאית, בסוגים שונים של תאית. כאן, במרכז המחקר לביו-אנרגיה של הגדולים (Great Lakes Bioenergy Research Center), אנו מפתחים טכנולוגיה להמרת סוכרים אלו לדלקים ביולוגיים. על מנת לזהות חומר גלם צמחי אופטימלי, עלינו להעריך תחילה את סוגם ואת שפע הסוכרים הנוכחים בביומסה זו.

בסרטון אחר בשם ניתוח הרכבי מקיף של דפנות תאי צמחים, חלק ראשון: ליגנין, נתמקד בניתוח פוליפנולים. אז בואו נתחיל. התחילו את הפרוצדורה זו על ידי בידוד דפנות התאים.

גרסו כ-60 עד 70 מיליגרם של חומר צמחי מיובש עם כדורי פלדה נססית בקוטר 5.5 מילימטר בתוך מבחנה עם מכסה הברגה של SAR TED בנפח של שני מיליליטר. כחלופה בעלת תפוקה גבוהה, השתמשו במטחנת REM וברובוט גריסה וחלוקה הנקרא eyewall כפי שמתואר בחלק הראשון. עם השלמת הגריסה, הוציאו את כדורי הפלדה.

המשיכו לבודד את דפנות התאים ולהסיר עמילן שיורי כפי שהוצג בחלק הראשון וכפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב המצורף. שקלו 2 mg של חומר דופן תא של עמילן DS לתוך פרועת מיקרויעק (tube) בנפח של 2 מיליליטר. דרך יעילה בעלת תפוקה גבוהה לביצוע משימה זו היא באמצעות רובוט ה-eyewall.

הרובוט לוקח מבחנה המכילה חומר צמחי גרוס ומנקב חור בתחתית המבחנה. המבחנה המנוקבת מונחת לאחר מכן על מזין VI. מבחנה ריקה מונחת על מאזניים ומוזזת תחת מזין ה-VI באמצעות רעידות; החומר חולל דרך החור במבחנה העליונה הטעונה אל תוך המבחנה התחתונה הריקה, עד להצטברות הכמות הרצויה של החומר.

הוסיפו 100 micrograms של acetol כסטנדרט פנימי. שטפו את דפנות המבחנה באצטון כדי לרכז את חומר דופן התא בתחתית המבחנה, ואפרו את האצטון בעדינות רבה תחת זרימת אוויר. לאחר מכן, בצעו הידרוליזה בחומצה חלשה.

הוסיפו בזהירות 250 µL של חומצה טריכלורואצטית בריכוז 2 M או TFA לכל דגימה, תוך כדי הקפדה שלא יתרסס חומר על דפנות המבחנה. סגרו את המבחנות היטב והדגירו בבלוק חימום בטמפרטורה של 121 °C למשך 90 דקות. לאחר מכן, קררו את בלוק החימום ואת הדגימות על קרח, וסובבו את המבחנות בצנטריפוגה במהירות של 10,000 RPM למשך 10 דקות.

העבירו 100 microliters של העילוי החומצי המכיל את הסוכרים המומסים של הפוליסכריד של המטריצה למבחנות עם פקק הברגה, תוך הקפדה שלא להפריע למשקע. ניתן להשתמש במשקע עבור בדיקת תאית גבישית. אידו את ה-TFA בתוך מבחנה מזכוכית תחת זרימה עדינה של אוויר במכשיר אידוי.

הוסיפו 300 µL של פרופאנול (two propanol) כדי להסיר חומצה עודפת, ערבבו במערבל Vortex ואידו בטמפרטורה של 25 °C. חזרו על הפעולה שלוש פעמים בסך הכל. על מנת לאפשר זיהוי של המונוסכרידים באמצעות כרומטוגרפיה גזית, בצעו דריבטיזציה של אלדול אצטט (aldol acetate derivitization).

ראשית, חסרו את המונוסכרידים לאלדולים במבנה טבעת פתוחה המתאימים להם, ואתם אצטילו אותם. עיינו בפרוטוקול הכתוב המצורף להוראות מפורטות. כל שלב בפרוטוקול עוקב אחר הנוהל שהוצג קודם לכן: הוספת ריאגנט, דגירה, אידוי תחת זרם אוויר, ולאחר מכן הסרת עודפי ריאגנט באמצעות שלבי שטיפה שונים.

בשלבים הסופיים, מבצעים מיצוי של ה-aldol acetates. ראשית, יש להוסיף 500 µL של ethyl acetate ולערבל בעדינות. לאחר מכן, יש להוסיף 2 mL של מים, לסגור את המבחנות במכס ולהפעיל וורטקס; סובב את המבחנות בצנטריפוגה במהירות של 2000 RPM למשך חמש דקות כדי לקבל שכבות נפרדות וצלולות, כאשר שכבת ה-ethyl acetate נמצאת למעלה ומכילה את ה-aldol acetates ושכבת המים נמצאת למטה. העבר בעזרת פיפט 50 µL משכבת ה-ethyl acetate למבחנות GC-MS עם inserts; דלל על ידי הוספת 100 µL של acetone למבחנת ה-GC. ניתן לאחסן את מבחנת ה-GC בטמפרטורה של 4 °C.

אם ניתוח ה-GCMS אינו מתבצע באופן מיידי, הזרק את הדגימות לכרומטוגרף גזי המצויד בספקטרומטר מסות ארבע-קוטבי (quadrupole mass spectrometer). לפרטים על העמודה ועל מהלך הריצה, נא לעיין בפרוטוקול הכתוב המצורף। חומר המוצא לקביעת תכולת התאית הגבישית יכול להיות חומר דופן תא מבודד או חומר דופן שכבר טופל בחומצה חלשה TFA, מיד לאחר הטיפול בחומצה או בצורה מיובשת הניתנת לאחסון.

לאחר הסרת עודפי TFA באמצעות איזו-פרופנול כפי שהודגם קודם לכן, הוסף למשקע ה-TFA בשתי המבחנות 1M של ריאגנט degra המורכב מחומצה אצטית, חומצה חנקית ומים, ביחס של 8:1 עד 2:1 (נפח לנפח). סגור את המבחנה היטב, ערבב במכשיר vortex וחמם על גבי בלוק חימום בטמפרטורה של 100 °C למשך 30 דקות. כתוצאה מטיפול זה, רק תאית גבישית תישאר במשקע.

את כל שאר הפוליסכרידים יש להידרוליז. קררו את הדגימות בבלוק על קרח עד לטמפרטורת החדר או פחות מכך. לאחר מכן, סבבו את הדגימות בצנטריפוגה ב-10,000 RPM למשך 15 דקות. לאחר הסבב, השליכו את הנוזל העליון (supernatant) תוךما לוודא שהמשקע (pellet) אינו מזועזע ושחומר מהמשקע אינו מוסר. לשם כך, השאירו כ-150 microliters מהנוזל העליון במבחנה, ושטפו את המשקע מספר פעמים במים.

בשלב הבא, בצעו הידרוליזה באמצעות חומצה גופרית רכזת על מנת להמיס לחלוטין את הגביש ואת כדורית התאית לגלוקוז. התחילו בהוספת 175 µL של חומצה גופרית 72% לתוך נבובת הסארטה והד기로 למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה הראשונית, ערבבו את הדגימה במערבל וורטקס והד기로 למשך 15 דקות נוספות.

לאחר מכן, הוסיפו 825 µL של מים, ערבבו במערבל Vortex וסובבו את הדגימות בצנטריפוגה במהירות של 10,000 RPM למשך חמש דקות. ייתכן שחומר חום ומסיס, בעיקר ליגנין, יישאר במבחנה בעוד שהגלוקוז יימצא בתמיסה העליונה. תכולת הגלוקוז בתמיסה העליונה תימדד באמצעות בדיקת anthrone קולורימטרית.

בדיקה זו מבוצעת בלוחית מיקרוטיטר מפוליסטירן בעלת 96 בארות. הכינו עקומת סטנדרט של גלוקוז בשכפול, בהתאם להוראות בפרוטוקול הכתוב המצורף. הכינו את הדגימות על ידי ערבוב של 10 µL מכל דגימה, supernatant, ו-90 µL מים בבארות נפרדות באותה לבית המיקרוטיטר שבו נמצא הסטנדרט; השלימו את התהליך על ידי הוספת 200 µL של ריאגנט שהוכן טרי ושורש.

בשלב הבא, חממו את הפלטה למשך 30 דקות בטמפרטורה של 80 °C בתנור עם מפיץ חום מאלומיניום. שימו לב כי הדגימות המכילות גלוקוז משנות את צבען מצהוב לכחול-ירוק עם סיום החימום. הניחו לפלטה להתקרר לטמפרטורת החדר ונערה אותה היטב.

מדדו את הבליעה באורך גל של 625 ננומטר באמצעות קורא לוחיות מיקרוטיטר. תכולת הגלוקוז, אבן הבניין של התאית, מחושבת על בסיס הבליעה בהשוואה לעקומת הסטנדרט שנקבעה על אותה לוחית. להלן מספר תוצאות מייצגות של ניתוח הפוליסכרידים של פיסת עץ צפצפה.

פיקי הגז כרומטוגרם מזוהים על פי פרופילי מסות ו/או זמני התמסכות של סטנדרטים. כמות המונוסכרידים נקבעת על בסיס עקומות סטנדרט. ניתוח הסוכרים של הפוליסכרידים במטריצה מראה שפע גבוה של xylose המייצג hemi cellulose xam, אך סוכרים נוספים נמצאים שם גם כן.

על פי הניתוח, 40% מחומר הצפצפה מורכב גבישים ותאית. שימו לב כי תכנים והרכבים אלו עשויים להשתנות מצמח לצמח או בין מבנים אנטומיים שונים של הצמח. הצגנו בפניכם כיצד לקבוע את תכולת הפוליסכרידים ואת הניתוח ההרכבי של ביומסה ליגנו-צלולוזית לצורך ניתוח של ליגנין פוליפנולי.

צפו בחלק הראשון. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.