חשיבותה של ריכוז חלבון נכון עבור קינטיקס וקביעת זיקה בניתוח מבנה פונקציה

המטרה הכללית של מאמר וידאו זה היא לספק תשובות לשתי השאלות הבאות. ראשית, האם ניתן לבצע מחקרים של אינטראקציות בין חלבונים בצורה מהימנה יותר על ידי מדידת החלק מדגימת החלבון המסוגל למעשה להיקשר לחלבון אחר? שנית, כיצד יכול ניתוח קינטי להעניק לנו הבנה טובה יותר של קשרי מבנה ותפקוד?

שתי השאלות הללו ייבחנו בניסוי המשתמש ב-Corp X 100, מכשיר המזהה אינטראקציות בין חלבונים בזמן אמת ללא שימוש בתוויות. ניסוי זה יבחן את האינטראקציה של bovine cystatin B עם הפרוטאוז cystine papain; מבנה הגביש של שני החלבונים במתחם מצביע על מספר שאריות המעורבות בקישור לפרוטאוז, וזאת כדי לקבוע כיצד כל אחת מהשאריות המשתתפות באינטראקציה משפיעה על האינטראקציה בין cystatin B ל-papain. מספר וריאנטים של cystatin B הופקו באמצעות מוטגנזה מכוונת לאתר (site directed mutagenesis).

בניסויים מסוג זה, קיימת תמיד האפשרות שחלבונים רקומביננטיים לא יקפלו בצורה נכונה, יצברו אגרגטים או יתכלכלו, מה שיוביל לתוצאות שגויות שאינן ניתנות לשחזור. למכשיר VIACORE X 100 יש את היכולת לקבוע את חלק החלבון הזמין לקישור באמצעות ניתוח ריכוז ללא כיול, המכונה CFCA. גישה זו מאפשרת לקבוע את ריכוז החלבון ששמר על פעילות קישור, גם כאשר סטנדרטים לכיול אינם זמינים.

בשיטה זו ייעשה שימוש ב-CFCA כדי לקבוע את ריכוזה של הווריאנטים של cystatin B. נתונים אלו ישמשו לאחר מכן כקלט לקביעת קינטיקת ההיקשרות של הווריאנטים של cystatin B ל-Pepin, הנמדדת אף היא באמצעות BOR X 100. שלום, אני CLA gram מ-GE Healthcare בשוודיה.

היום עמיתתי, Eva Pool, תראה לכם כיצד לבצע ניתוח של קשר בין מבנה לתפקוד באמצעות BOR X 100. חלבונים רקומביננטיים עלולים להפגין קיפול לקוי או ירידה בפעילות עם הזמן, והתנהגות זו אינה ניתנת לגילוי בשיטות המסתמכות על מדידת ריכוז כולל. הדבר עלול להוביל בפועל לנתונים קינטיים שגויים בעקבות מדידות ריכוז בשיטה של ניתוח ריכוז ללא כיול. B.A core X 100 משמש לניתוח הקינטיקה והזיקה של האינטראקציה בין וריאנטים של cystatin B לבין pepane.

פרמטרים אלו יספקו תובנה לגבי מנגנון הקשירה. נתחיל בהסבר קצר על מערך הניסוי, אז בואו נתחיל. האינטראקציה בין ה-cystine, protease, papin לבין המעכב cystatin B נשלטת על ידי מגעים הידרופוביים, כפי שנחשף במבנה הגביש של שני החלבונים בקומפלקס.

מצד המעכב, אזורי המגע הם הקצוות ה-N וה-C ושתי לולאות סיכה (hairpin loops). במחקר זה נבדקים ארבעה מוטנטים, שבכל אחד מהם הוכנסה מוטציה של ציסטאין כדי למנוע דימריזציה של cystatin B. בהתבסס על ההקשר שנחשף במבנה הגבישי, leucine 73 הוחלף ב-glycine, histamine 75 הוחלף ב-glycine, ו-tyrosine 97 הוחלף ב-alanine. שתי מוטציות ה-glycine הוכנסו כדי לבחון את חשיבות שרשראות הצד של histidine 75 ו-leucine 73 להסתמכות ל-Pepin, ושייר ה-tyrosine הוחלף ב-alanine כדי לחקור את האינטראקציה בין הקצה ה-C של cystatin B ל-Pepin.

שלושת המוטנטים הכפולים, כמו גם שלושה מוטנטים בודדים של INE לסורי, נבדקו לאינטראקציה שלהם עם גרסה שאינה פעילה קטליטית של Papain S methyl popin. צורה זו שאינה פעילה קטליטית של הפרוטאוז כוללת קבוצת מתיל המחוברת ל-CYS 25 בסדק הפעיל. למען הפשטות, נקרא לגרסה זו propan לאורך כל הפרוטוקול.

שיטת CFCA מתבססת על מדידה של קצב הקישור בתנאים שבהם הקצב מוגבל על ידי דיפוזיה של מולקולות האנליט אל הפני השטח. תנאי זה מושג באמצעות רמות קיבוע גבוהות של הליגנד. לפני תחילת הליך הקיבוע, הניחו את תמיפת ה-HEPs המשמשת בניסויים במגש השמאלי והחדירו את שתי הפומפות.

הניחו גם בקבוק פסולת ריק על המגש הימני. לאחר מכן, הכניסו חיישן gypsum five חדש למכשיר, בצעו אתחול באמצעות תוכנת core X 100, ובמסך הפתיחה לחצו על הפריט dock chip tool. לחצו על start doc בתוכנה.

בשלב הבא, השתמשו באשף הקיבוע (immobilization wizard) כדי להגדיר את הקיבוע על ידי בחירה ב-amine coupling ל-sensor CM5; ממסך הפתיחה, לחצו על כפתור other options, ולאחר מכן בחרו ב-wizards. פעולה זו תפתח חלון עם האשפים הזמינים. בחרו ב-immobilization ולאחר מכן לחצו על כפתור new בפינה הימנית התחתונה. יופיע המסך הראשון של אשף הקיבוע, כאשר amine coupling ל-sensor CM5 מוגדר כברירת המחדל.

סמנו את התיבה תחת תא זרימה שתיים (flow cell two) כדי לבצע קיבוע בתא זרימה שתיים. תא זרימה אחת נותר ללא שינוי כדי לשמש כמשטח ייחוס מתוך שלוש האפשרויות הזמינות להלן. סמנו את תיבת הגדרת זמן המגע (specify contact time), כאשר רמת היעד מימין משתנה לזמן מגע, והגדירו זמן מגע של 900 seconds.

בשלב הבא, הזינו את פרמטרי הסמיכה תחת תמיסת המולקולה הלוכדת/ליגנד. הזינו papain. לאחר מכן לחצו על הבא.

המסך הבא מציג את פריסת מתקן הדגימות. מיקום 1 יכיל את ה-ethanolamine המשמש לנטרול השאריות הפעילות לאחר צימוד הליגנד papain לפני השטח של השבב. הכניסו את תמיסת ה-ethanolamine במיקום 1 ובמיקום 2.

הניחו את הליגנד פאפאין (papain); הפאפאין מאוחסן בעודף של מתיל סולפט ומהול ל-50 micrograms per milliliter בבופר נתרן אצטט 10 millimolar, pH 4.5. שחזרו את רכיבי הצימוד EDC ו-NHS מהערכה לצימודו של אמין באמצעות מים מזוקקים פעמיים. שאיבו 85 microliters של EDC אל תוך מבחנה. סגרו אותה והניחו אותה בעמדה שלוש.

השתמשו באותו נפח עבור NHS בעמדה ארבע. שימו לב שקובץ חמש צריך להיות סגור וריק כדי שהמכשיר יוכל לערבב את ED, C ו-NHS בקובץ זה. כמו כן, זכרו למלא את קובץ השטיפה בעמדה H2O במים דה-יוניים טריים.

כאשר המתקן מלא בהתאם למתווה המופיע על המסך, לחצו על load samples והכניסו את המתקן למכשיר. לאחר שהמתקן הוכנס, לחצו על next. לפני תחילת ההרצה, תוצג רשימת תיוג (checklist).

וודאו שכל הנקודות ברשימה בוצעו כאשר הדבר נדרש. ההפעלה מתחילה בלחיצה על כפתור ההפעלה. ההפעלה מתבצעת במהלך הליך האימוביליזציה.

הנתונים נאספים בזמן אמת. ראשית, מזריקים את סוכני הצימוד. לאחר מכן מצמידים פפטיד למשטח השבב, וההליך מסתיים בנטרול האסטרים הפעילים שנותרו.

בסיום ההרצה, חלון דיאלוג מסכם את תוצאות ההרצה. בחלון זה מוצגת רמת האימוביליזציה. הליך ההצמדה המלא אמור להביא לכך שכ-3000 RU של פפאין יהיו אימוביליזים.

לאחר שהפאפאין קובע על שבב החיישן, התחילו בניתוח CFCA על ידי דילול דגימות המוטנט של cystatin B לריכוז כולל של כ-10 nanomolar בנפח של לפחות 300 microliters. רשמו את מקדם הדילול, שכן נשתמש בו מאוחר יותר בהגדרות הבדיקה. התחילו בהעלאת דיאלוג ה-"wizard" כפי שתואר בסעיף הקודם בחלק הריכוזים של תיקיית הבדיקה.

בחרו ב-calibration free, ולאחר מכן בחרו ב-new. המסך הראשון של האשף מציג את רצף ההזרקה. ניתן להשאיר את ההגדרות ללא שינוי, מכיוון שבמקרה זה נעשה שימוש בשבב חיישן CM five ובגישת בדיקת קיבוע ישיר (direct immobilization assay).

לחצו על next במסך הבא. השאירו את תיבות הסימון prime before run ו-run startup cycles מסומנות. כמו כן, השאירו את מספר מחזורי ההפעלה כברירת המחדל שלו, שלושה.

הזינו heaps buffer בשדה שם התמיסה. לאחר מכן לחצו על next. במסך הבא, הזינו את שם תמיסת הרגנרציה, שהיא 20 millimolar sodium hydroxide.

השאר את שאר הפרמטרים ללא שינוי. לחץ על next כדי לצפות בטבלת הדגימות. הגדר את הדגימות בהתאם לטבלת הדגימות.

כל שורה בטבלת הדגימות מניבה שני מחזורים. אחד עם קצב זרימה של 10 µL לדקה ואחד עם 100 µL לדקה. יש להתחיל את ההרצה עם בלאנק.

לאחר מכן, הזינו את השם, מקדם הדילול, מקדם הדיפוזיה ב-20 °C והמשקל המולקולרי. עבור כל מוטציה, ניתן לחשב את מקדם הדיפוזיה באמצעות הכלי המקוון באתר המוצר. קישור לכלי זה מופיע ב-support navigator של התוכנה.

מכיוון שמומלץ להריץ כל דגימה ובשכפול, העתיקו את הטבלה כולה מהשורה הריקה ועד לדגימה האחרונה והדביקו אותה בתחתית הטבלה. לחצו על "הבא" כדי להמשיך. המסך הבא יציג את מתקן הדגימות.

הניחו את הדגימות והריאגנטים במגש בהתאם לסידור המפורט בתוכנה. טענו את המגש למכשיר על ידי לחיצה על כפתור טעינת הדגימות (load samples). לאחר מכן לחצו על הבא (next).

לאחר טעינת הדגימות, מופיע מסך תזכורת עם רשימת בדיקה. ודא שכל הפריטים סומנו ולאחר מכן לחץ על start. הנתונים נאספים בזמן אמת במהלך ההרצה.

בסיום ההרצה, סגור את החלון המציג את הנתונים שנאספו. שים לב שפריט תוצאה חדש הופיע בחלון הראשי. כדי לחשב את הריכוזים מתוך הנתונים, בחר את פריט התוצאה החדש ולחץ על הכפתור.

בצע הערכה באמצעות core X 100. הפעל את תוכנת ההערכה המציגה את כל הנתונים שנאספו, ובחר מסרטון הכלים בניתוח ריכוז (concentration analysis), ולאחר מכן בכיול חופשי (calibration free) מהתפריט. בחלון הראשון, בחר את הנתונים שיכלול הניתוח.

גללו ברשימה ועברו על רשימת התצוגה כדי לצפות בנתונים של כל הדגימות. אם ברצונכם להחריג נתונים כלשהם, הסירו את סימון ה-V מהרשימה. לחצו על "Next" כדי להתחיל בחישוב.

מודל האינטראקציה של CFCA מותאם באופן אוטומטי לנתונים הניסיוניים; עם השלמת ההתאמה, התוצאות מוצגות עבור כל דגימה בחלון התוצאות. ניתן לעבור בין ההתאמות של כל דגימה על ידי בחירת השורה המתאימה בטבלה. העמודה הנקראת measured concentration מציגה את הריכוז בדגימה שנבדקה.

הריכוז בדגימה המקורית מחושב באמצעות מקדם הדילול שהוזן קודם לכן ומוצג בעמודת הריכוז המחושב; בסיום הפעולה, לחץ על "סיום" (finish) כדי לשמור את התוצאה. כעת, לאחר שידועים לנו ריכוזי החלבונים מניתוח ה-CFCA, יש לנו בסיס מצוין למדידות הקינטיות הבאות. ניתוח קינטי יעזור לנו כעת להבין את חשיבותם של שאריות חומצות אמינו מרכזיות עבור מנגנון הקשירה.

נתחיל בהגדרת הניתוח הקינטי. הניתוח הקינטי מתחיל בהכנסת שבב חיישן CM5 חדש למכשיר במסך הפתיחה. בחרו ביצירת תבנית עבודה (workflow) של בדיקה עבור זיקה קינטית.

בפינה השמאלית העליונה מופיע חלון דיאלוג שבו מוזנים פרטים על הליגנד. הזן את השם papain בתיבת שם הליגנד ובחר חלבון אחר מרשימת סוגי המינים. לאחר מכן, בחר באפשרות immobilize ligand covalently using sensor chip CM five מבין שתי גישות חיבור הליגנדים המוצגות; זרימת העבודה המומלצת לבדיקה מתוארת כעת בצד ימין של החלון.

התהליך מתחיל בשלב קיבוע ולאחריו שלב בדיקה. לחצו על המשך כדי להמשיך. שמרו את זרימת העבודה של הבדיקה כפי שנדרש על ידי הזנת שם ולחיצה על שמור.

התוכנה מציגה כעת את זרימת העבודה של הבדיקה עם כפתורים המשויכים לכל שלב. השלב הראשון תחת הכנת פני השטח של החיישן הוא מציאת pH של מובליזציה. מכיוון ש-pH זה ידוע, לחץ על "הזן ערך ידוע" (enter known value) בתיבת הדיאלוג המופיעה.

הזינו את שם התמיס acetate ואת pH 4.5 ובחרו ב-save. זרימת העבודה של הבדיקה מעודכנת כעת עם סימן וי ירוק המציין כי שלב זה הושלם. כעת הגיע הזמן לקיבוע; לחצו על כפתור ה-run בשלב ה-immobilized.

שלב זה מעלה את אותו אשף הגדרות ששימש עבור הפרופאן והקיבוע עבור ניתוח ה-CFCA; קיבוע הפאפין לניתוח קינטי מוגדר כאן באופן דומה, למעט הזרקת תמיסה מדוללת יותר למשך זמן קצר יותר. זאת כדי לקבע פחות פאפין ולמנוע מצבים שבהם קצבי הקישור של מוטציות ה-cystatin מוגבלים על ידי דיפוזיה, כך שניתן יהיה למדוד נתונים קינטיים באופן מבודד. מאחר ששם הליגנד וה-pH של הקיבוע הוזנו בשלבים קודמים בזרימת העבודה של הבדיקה, שניהם מוגדרים כאן כברירת מחדל.

העדכון היחיד הנדרש הוא 50 שניות עבור זמן המגע. לאחר מכן, תהליך הקיבוע ממשיך כפי שהוצג קודם לכן. רמת התסריף הצפויה לאחר הקיבוע היא 50 R ru.

סימן וי ירוק לצד כפתור ההפעלה מעיד על כך שהקיבוע הושלם. לאחר מכן, הגדר את תמיסת הרגנרציה בשלב הרלוונטי בתהליך העבודה. ניתן למצוא תנאי רגנרציה על ידי לחיצה על "enter known values" בתיבת הדו-שיח שמופיעה.

הזינו את תמיסת הרגנרציה ואת זמן המגע. לאחר מכן לחצו על שמירה. כעת, כאשר הליגנד מקובע ותנאי הרגנרציה הוזנו, הכל מוכן להפקת נתוני קינטיקה; בתיבת Run Kinetics Affinity Assay, לחצו על כפתור ההפעלה (Run) כדי להתחיל את השלב הראשון בקינטיקה.

הסרטן של Affinity wizard מפרט את רצף ההזרקה של כל מחזור עבור קינטיקה של מחזור בודד, כפי שנעשה כאן, ואין צורך לשנות דבר. לחצו על "next" כדי להמשיך. בשלב הבא, השאירו את הגדרות ברירת המחדל המצביעות על הכנת המערכת (priming) לפני ההרצה.

בחרו להריץ מחזור הפעלה אחד כדי להגיע לשיווי משקל על פני השבב. לאחר מכן, הגדירו את פרמטרי ההזרקה עבור הדגימה. מאחר שתמיסת הרגנרציה הוגדרה קודם לכן וההגדרות הן קבועות מראש, אין צורך לשנות אף אחד מהפרמטרים במסך.

לחצו על הבא. לבסוף, הגדירו את הדגימות. הזינו שתי שורות עבור כל גרסה מוטציה, אחת ריקה והשנייה עם דגימה.

מחזור ריק מוגדר על ידי קביעת פרמטר הריכוז הגבוה ביותר לאפס. ניתן להתאים שניים מערכובים של Cystatin B בכל הרצה. עבור כל מוטציה, הזן את המשקל המולקולרי, הריכוז הגבוה ביותר ומקדם הדילול, ולאחר מכן לחץ על הבא.

במסך הבא, מסגרת מדף הדגימות מודגשת. הכינו סדרת מהולות של דגימות החלבון והניחו את המבחנות עם הפקקים במדף. כפי שמודגש על המסך, מבחנה עם בופר תונח בעמדה 13 ומבחנה עם תמיסת רגנרציה תונח בעמדה 14. ודאו שאתם ממלאים את עמדת המים במים טריים.

הניחו את הרכיב (rack) במכונה וטענו את הדגימות על ידי לחיצה על כפתור טעינת הדגימות (load samples) ולחצו על הבא (next). כפי שנעשה קודם לכן, בצעו בדיקה סופית לפני תחילת הרצת הניסוי על ידי לחיצה על התחל (start); נתוני האינטראקציה יופיעו בזמן אמת. עם סיום ההרצה, המשיכו מיד בהרצת שאר הווריאנטים של cystatin B כפי שהודגם כעת.

אם גרסאות cystatin B הנותרות מורצות one after another, יש לדלג על שלב ה-prime ומחזור ההפעלה (startup cycle) על ידי ביטול הסימון בתיבות הסימון המתאימות בשלב. עם סיום כל הרצה, ניתן לגשת לנתונים דרך הקישור. כל התוצאות נמצאות בזרימת העבודה של הבדיקה.

חלון דיאלוג עם כל התוצאות שהופקו במסגרת זרימת עבודה זו יופיע. כדי לחשב את קבועי הקצב הקינטיים, בחר את התוצאה להערכה ולחץ על evaluate; תוכנת ההערכה be a core X 100 תופעל מחדש ותציג את כל הנתונים שנאספו. בחר kinetics affinity מתפריט סרגל הכלים.

במסך הראשון, מוביא למשפט הבדיקה את המוטנט cysteine three to Syrian להערכה. הנתונים של מוטנט זה מוצגים יחד עם הרצת הבלנק שבוצעה עבור מוטנט זה; כדי להמשיך, יש ללחוץ על Next. המסך הבא מציג את הנתונים לאחר חיסור הרצת הבלנק מהרצת הדגימה.

בחרו להעריך קינטיקה על ידי לחיצה על כפתור ה-kinetics. כעת בחרו להתאים את הנתונים למודל אינטראקציה של אחד-לאחד. לאחר לחיצה על כפתור ה-fit, ההתאמה תוצג על המסך תוך כדי חישובה.

ברגע שהתהליך מוכן, בקרות איכות מוחלות באופן אוטומטי ומודגשות בחלק התחתון. עברו על פריטי בקרת האיכות ולאחר מכן בחנו את נתוני הסנסורגרם (sensor gram) כדי לוודא שהסנסורגרמים מראים קימור מספיק. כמו כן, בחנו את תרשים השאריות המציג את ההבדלים בין הנתונים שנאספו לבין המודל המותאם.

שימו לב לסטיות סיסטמטיות שאינן אקראיות. התאמה זו היא מקובלת. כעת עברו לסקור את הנתונים הקינטיים בלשונית הדוח.

קבוע קצב ההתחברות, קבוע קצב הניתוק וקבוע הניתוק בשיווי משקל. עם הסיום, לחצו על finish וחזרו על אותו הליך עבור כל שאר המוטציות. להלן תוצאות מייצגות של אנליזת CFCA עבור גרסאות שונות של cystatin B שנבדקו.

נתוני ריכוז הקישור הספציפי מחולצים מהסנסורגרמים שהתקבלו בקצבי זרימה של 10 ו-100 microliters per minute. כאשר משווים את הריכוז שנקבע באמצעות מדידת two 80 לזה שנקבע באמצעות CFCA, ניכר כי בעוד שברוב המקרים החלבון פעיל באופן מלא עבור הווריאנט leucine 73 glycine, חלקו של החלבון הפעיל נמוך מאוד. קינטיקת הקישור של וריאנטים של cystatin B ל-pepin נקבעת באמצעות single cycle kinetics.

הסנסורגרמים מציגים נתונים לאחר חיסור של blank ושל רפרנס, כאשר מודל אינטראקציה של one-to-one מוצג מעליהם בשחור. ריכוז הקשירה הספציפי שנמדד ב-CFCA עבור הווריאנט leucine 73 הוא כ-10% בלבד מריכוז החלבון הכולל כפי שנקבע במדידת two 80. כאשר משתמשים בריכוז הנכון לחישוב הפרמטרים הקינטיים, מתברר שקצב האסוציאציה עבור Lucien 73 דומה לזה של הווריאנטים האחרים.

בעוד ששיעורי ההתאחדות של המוטנטים דומים לאלו של חלבון הטיפוס הפראי, קבוע קצב הדיסוציאציה של המוטנטים עשוי להיות גבוה יותר בכמעט שני סדרי גודל, עם עלייה תואמת בקבוע הדיסוציאציה בשיווי משקל. האפיניות המופחתת תלויה בעיקר בשיעורי דיסוציאציה מוגברים, מה שמעיד כי הן ללוליית הקישור השנייה והן לקצה ה-C של cystatin B יש תרומה לאפיניות הקישור על ידי השמרת הצמדת המעכב לאנזים לאחר שהקומפלקס נוצר. השימוש בניתוח ריכוז ללא כיול היה חיוני למסקנה זו, כיוון שאחד המוטנטים התגלה כבעל פעילות קישור נמוכה מאוד. עמיתי פול הראה לכם כעת כיצד להשתמש ב-bi core X 100 במחקר פונקציונלי מובנה. בעת ביצוע ניסויים אלו, חשוב לזכור שלמרות שגם ניתוח הריכוז וגם הניתוח הקינטי מבוססים על אותו הליך קישור, התנאים הניסיוניים שונים למדי.