ניתוח מערכות חלבון גדול על ידי ספקטרומטריית מסה מבנית

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לאפיין מקבצי חלבונים גדולים באמצעות ספקטרומטריית מסה מבנית. זאת מושג על ידי הכנת קפילריות מצופות זהב עבור יינון תרסית חשמלית בזרימה ננומטרית (nano flow electro spray ionization). כשלב שני, הדגימה מוכנה והספקטרומטר של המסה מכויל למדידות של מסות גבוהות.

בשלב הבא, תנאי הניסוי עוברים אופטימיזציה על מנת לשמר את קומפלקסי החלבון שלמים בפאזה הגזית. לאחר מכן נרכשים ספקטרום MS וספקטרום tandem MS. ספקטרום ה-MS הראו מצבי מטען התואמים במסתם לקומפלקס השלם, בעוד שניסויי tandem MS הניבו דפוסי התאגדות של מונומרים וקומפלקסים מופשטים.

שלום, אני נעם קיב מהמעבדה של מירון במכון וייטמן למדע, ואני יצחק קיי, גם אני מהמעבדה של מישלון. היום נרצה להראות לכם את הפרוצדורה הבסיסית לניתוח קומפלקסים חלבוניים גדולים באמצעות ספקטרומטריה מבנית, ואנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדה שלנו כדי לאפיין קומפלקסים חלבוניים ולהגדיר את הגאומטריה, ההרכב ורשתות האינטראקציה שלהם. אז בואו נתחיל.

ניתוח של קומפלקסים חלבוניים קשוריים שאינם זורמים מבוצע באמצעות טכניקת חיסון בריסס אוויר תוך שימוש בנימים מסוג emme plus או qua. ניתן למתוח נימיו של Capillary C לקצה דק בעלת קוטר של כ-one micron ולאחר מכן לצפתו בחומר מוליך כמו זהב. נימים אלו זמינים לרכישה מסחרית, כפי שניתן לראות כאן.

עם זאת, השימוש בהן הוא יעיל הרבה יותר מבחינה כלכלית. ניתן לקירר ולצפות את קפילריות הזכוכית כדי להביאן למצב של מוכן לשימוש; הקירור מבוצע במכשיר איסוף המחטים הזה, והציפוי במכשיר הציפוי הזה. כדי להתחיל בהליך זה, הצמידו שני רצועות של רפידה דביקה דו-צדדית לתחתית של צלחת פטרי, תוך שמירה על מרחק של 2 cm בין הרצועות.

הנח מוט זכוכית במרכז אחת הרפידות. רפידת הדבק מחזיקה את הנימים במקומם, ומוט הזכוכית תומך בנימים המוכנים ומונע מהקצוות שלהם להישבר. השתמש בנימי זכוכית בוריס (Boris silicate glass capillaries) בעלי קוטר חיצוני של 1 mm וקוטר פנימי של 0.78 mm.

הכנסו קפילרה אחת לתוך המחט, הדקו בעדינות את הקפילרה למקומה וכווננו את מיקומה כך שתהיה במרכז פילמנט החימום. הדקו את התפסנים בעדינות עד שהקפילרה מוחזקת בצורה יציבה בשני קצותיה. משכו את הקפילרה באמצעות התוכנית שהוגדרה מראש המופיעה כאן.

עם זאת, זכרו שתהליך התכנות של המשיכה הוא תהליך של ניסוי וטעייה. עד לקבלת צורת קצה מקובלת, כל קפילרה שנמשכת מניבה שתי קפילרות מעוצבות סופיות. הוציאו את הקפילרות שנמשכו מהמכשיר ובדקו את הקצוות, והשליכו כל קפילרה המעוותת או שבורה.

השתמשו בפינצטה למיקום בעלת קצוות קהים כדי להניח את הקפילרות בצלוחית פטרי. בסיס הקפילרות מודבק לרפידת הדבק והחלק העליון נשען על מוט זכוכית כאשר הקצה פונה כלפי מעלה. המשיכו למשוך את הקפילרות עד שהצלוחית פטרי תהיה מלאה.

כ-80 קפילריים נכנסים לצלחית בקוטר 10 סנטימטרים. לאחר מכן, יש לצפות את הקפילריים בזהב. הכנס את הפלטה למכשיר ציפוי הזהב (gold sputter coater).

יש לוודא כי אספקת הגז נבחרה בהתאם להוראות היצרן ולהפעיל מחזור ציפוי שהוגדר מראש. את הציפוי חוזרים עליו שלוש עד שש פעמים עד שהנימיים מקבלים גוון זהוב אחיד. לאחר שהנימיים מוכנים, יש להמשיך לכיול של ספקטרומטר המסות.

מרבית הניסויים שנערכו על קומפלקסי MultiPro בוצעו באמצעות ספקטרומטר מסות מסוג Electrospray quadruple time of flight, כגון זה. מערכת ההזנה היא מבית Waters, והיא מותאמת למסות גבוהות. לפני טעינת דגימת החלבון, יש לכלול את ספקטרומטר המסות באמצעות caesium iodide.

ראשית, הכינו תמיסה של 100 milligrams per milliliter של caesium במים מופקאים; Caesium משמש לכיול מסה גבוהה, מכיוון שצבירי מלחים בעלי מטען יחיד משתרעים על טווח מסות רחב, מ-393 mast to charge ratio ועד למעלה מ-10,000. בעזרת פינצטה קהה, קחו קפילרית מצופה מתוך פטריית פטרי והטעינו שתי microliters של תמיסת ה-cesium אל תוך הקפילרית.

השתמשו בקצה טעינה של ג'ל einor. החליקו את התמיסה לעבר קצה הנימי, באופן ידני או באמצעות מתאם לספינ-דאון. הכניסו את הנימי למחזיק הנימיים וכוונו אותו כך שהקצה יהיה במרחק של כ-10 millimeters מקצה המחזיק.

הניחו את הקפילריה תחת מיקרוסקופ אופטי והשתמשו בפינצטה חדה מסוג AA כדי לקצץ את הקצה. חשוב לוודא שאין בועות אוויר בתוך הקפילריה שעלולות לחסום את הזרימה ושהקפילריה אינה סתומה. בנוסף, ודאו שציפוי הזהב לא התקלף מהקפילריה.

אם כן, החליפו את הנימיון או קצצו את הקצה והסירו את החלק שאינו מצופה. לאחר מכן, חברו את מחזיק הנימיון לממשק nano flow ESI. סובבו את במה ש-XY, Z לאחור כדי למנוע נזק לנימיון ודחפו את הבמה למצב הפעיל שלה.

יש להניח את הקפילרה במרחק של 1 עד 10 מילימטרים מפיה של החרוט. יש להחיל מתח קפילרי ולחץ ננו-זרימה נמוך עד לתחילת הריסוס. לאחר מכן, יש לנסות להפחית את לחץ הננו-זרימה לערך מינימלי.

בצעו אופטימיזציה לעוצמת האות על ידי כיוון מיקום במהבת ה-XYZ, מתח הנימיות, לחץ הזרימה הננומטרי וזרימת גז הדיססולבציה. כדי לגלות טווח מסות רחב של סדרות שיאי עונה, יש לבצע אופטימיזציה למתחי ההאצה. הפרמטרים ששימשו כאן הם: מתח נימיות של 1.3 עד 1.7 kilovolts, קונוס דגימה של 80 עד 150 volts, וקונוס מיצוי של אחת עד שלוש volts כדי למטב את התמסורת של יונים בעלי מסה גבוהה, הדורשים תנאי דסולבציה עדינים.

לחץ התמיכה (backing pressure) מועלה לחמישה עד שישה מיליבר בשלב הוואקום הראשוני בין המקור למנתח. כדי להעלות את לחץ התמיכה, הפחת בזהירות את המוליכות של קו הוואקום של המקור אל משאבת הסקרול (scroll pump) על ידי סגירה חלקית של שסתום הבידוד תוך ניטור ההשפעה על עוצמת האות. עם השלמת הגדרת ספקטרומטרי המסות, אסוף כ-30 סריקות בקצב של סריקה אחת לשנייה בטווח יחס מטען ראשי שבין 1000 ל-15,000; לאחר הרכישה, בצע כיול של זמן המעוף (time of flight) באמצעות טבלת הכיול המתאימה.

כעת, לאחר השלמת הכיול, ניתן להטעין את דגימת החלבון. את הדגימה מכינים לפני כיול ספקטרומטר המסה, כאשר נדרשים ריכוזים נמוכים של מיקרו-מולאריות. במידת הצורך, רכזו את הדגימה באמצעות התקני סינון אולטרה-צנטריפוגליים.

ודאו שקומפלקס החלבון אינו נספג לממברנת המכשיר לפני השימוש. מכיוון שבדיקת הנפח ובליעת ה-UV מאפשרת שימוש בממסים נדיפים בלבד עבור NESI, לעיתים קרובות יש צורך בהחלפת בופר. ניתן להשתמש בעמודת סינון ג'ל במיקרו-צנטריפוגה כדי להסיר את כל השאריות של מלחים, מולקולות בופר או כל תוצרי לוואי נדיפים אחרים.

במקום זאת, השעו את הדגימה בתמיסע מימית של ammonium acetate. שלב קריטי זה קובע את איכות הספקטרה.

חזור על החלפת התמיס (buffer exchange) עד שלוש פעמים תוך דילול מינימלי, פחות מגורם של 1.3 לכל מכשיר, עד להשגת החלפה מקסימלית. אם נדרשים גם ריכוז וגם החלפת תמיס, ניתן לבצע אותם יחד באמצעות סינון אולטרה-צנטריפוגי כפי שהודגם בתחילת סעיף זה. לאחר מכן, טען את הדגימה כפי שהודגם עבור כיול caesium iodide והפעל את הריסוס.

התחילו באופטימיזציה ראשונית של התרסיס עד להשגת זיהוי של האות. השתמשו במשוואה למצב טעינה ממוצע המוצגת, כאשר M הוא המסה של הקומפלקס. עם זאת, ב-Daltons, המיקום המדויק של מצבי הטעינה תלוי בחלבון.

כדי למנוע דיסוציאציה של קומפלקסים, אין לחמם את מקור הברזל. יש לכבות את המחמם או לשמור על טמפרטורה הנמוכה מ-40 °C. שנו את מיקום הנימא, ואת המתחים של กรדיאנט הדגימה (sample cone) והמיצוי (extractor).

כדי למקסם את העברת הברזל, נקודת התחלה אפשרית היא מתח קונוס (cone voltage) של 100 וולט, מתח קונוס מיצוי (extractor cone) של 1 וולט ומתח קפילרי של 1.5 kilovolts. בדקו את השינוי שנוצר בספקטרום. בצעו אופטימיזציה של פרמטרים אלו בשילוב עם לחץ זרימה ננומטרי (nano flow pressure) כדי לשפר את הדה-סולבציה (desolvation) ולהסיר שאריות של מים ורכיבי בופר.

העלה את מתח ההטיה (bias voltage) בלחץ הגז בתא ההתנגשויות. מתחי הטיה טיפוסיים נעים בטווח של 10 עד 100 וולט, עם זרימת גז מלכוד של 1 עד 10 מיליליטר לדקה. בצע זאת בזהירות כדי למנוע התחברות של הקומפלקס, והתאם את אנרגיות ההתנגשות במלכוד ובמעבר.

לעיתים קרובות נדרשים מתחים גבוהים יותר, בדרך כלל בטווח של 10 עד 30 וולט, להעברה של יונים בעלי מסה גבוהה. בשלב זה, חשוב למנוע דיסוציאציה בהשראת התנגשות (collision induced dissociation) של הקומפלקס, כפי שמוצג כאן. לאחר הגעה לאות יציב, מומלץ להפחית את לחץ הזרימה הננומטרית ואת מתח הקפילריה לערכים מינימליים, תוך שמירה על התזה יציבה.

לאחר איסוף של מספר סריקות, יש להמשיך בזיהוי מרכיבי הקומפלקס באמצעות ספקטרומטריית מסה בטור (tandem mass spectrometry). לאחר קבלת אות אופטימלי ויציב עבור קומפלקס החלבון, יש לבחור יון מקור (precursor ion) ולהגדיר את מרכז המסה ברוחב הבידוד. בדרך כלל, רזולוציית מסה נמוכה של 12 ורזולוציית מסה גבוהה שבין 13 ל-15 משתמשות בטווח מסה רחב כדי לזהות תוצרי דיסוציאציה בעלי מסה גבוהה ומטען נמוך, ולאחר מכן יש להפחיתו לערכים הרצויים לצורך ביצוע ms.

בשיטה זו, ה-MS מפרק את קדם-היוני (precursor iron) על ידי הגדלת אנרגיית ההתנגשות, המסומנת בקיצור CE, והגברת הלחץ בתא ההתנגשות. הגבירו את ה-CE במלכודת (trap) או בהעברה (transfer) באופן הדרגתי בצעדים של 10 עד 20 וולט, והעלו את לחץ גז ההתנגשות ל-0 עד 5 מיליליטר לדקה. עקבו אחר השינויים בספקטרה עד להשגת תנאי הפעלה אופטימליים. אנרגיית הפעלה גבוהה עשויה להוביל לפירוק של תת-יחידה אחת או יותר מהקומפלקס השלם, ולהבהיר את זיקות האינטראקציה של תת-יחידות שונות.

בחר יותר ממטען אחד עבור אנליזת ms MS. במקרה של רכיבים חופפים, רכישת סט של ספקטרים של MS טנדם מסייעת בפתרון סדרת המטענים של האוכלוסיות השונות. יתרה מכך, מצבי מטען גבוהים יותר מתפרקים בקלות רבה יותר בהשוואה למצבי מטען נמוכים; חפוף את ה-MS וה-ms.

ספקטראי MS לתיקוף הבידוד של יון המוצא שנבחר. בנוסף לאפיון הקומפלקס השלם באמצעות MS ו-ms, תהליך ה-MS מייצר תת-קומפלקסים קטנים יותר בתמיסה תחת תנאי דנטורציה מתונים, ואלו מאופיינים אף הם.

ניתוחי MS ו-ms MS של תת-קומפלקסים מהווים את הבסיס להגדרת הארכיטקטורה של תת-היחידות בקומפלקס. לצורך הפרעה חלקית באינטראקציות בין תת-היחידות, הוסיפו בהדרגה ממסות אורגניות עד לריכוז של 50% או שנו אותו את ה-pH של התמיסה על ידי הוספת אמוניה או חומצה פורמית עד לריכוז של 4%. לבסוף, כדי לקבוע את המסה של תת-היחידות הבודדות המרכיבות את הקומפלקס, חשוב להשיג ספקטרום בתנאים דנטורטיביים. ניתן לבצע זאת באמצעות zip tip C four עם יחס של 25 עד 75 של מים ואצטוניטריל, כאשר 1% formic acid משמש כממס האלוציה. לאחר איסוף כל הנתונים, עבדו ונתחו את התוצאות כפי שפורט בפרוטוקול הכתוב המצורף. לפני טעינת דגימת קומפלקס החלבון, כילו את ספקטרומטרי המסות באמצעות cesium iodide.

סדרת הפסגות בעלות המרווחים השווים המסומנות באדום משתרעת על פני טווח רחב, מיחס מטען ראשי של 393 ועד למעלה מ-10,000. הן משויכות לצבירי מלח בעלי מטען יחיד בהרכב כללי של קומפלקס צסיום פלוס. אותים נוספים בין הפסגות העיקריות המסומנות בשחור נגרמים על ידי מינים בעלי מטען כפול ושלוש מהסדרות של קומפלקס צסיום שתיים פלוס וקומפלקס צסיום שלוש פלוס.

העלאת הלחץ בשלב הוואקום הראשוני חיונית לזיהוי צבירים בעלי מסה גבוהה. השפעת הלחץ על פיקי המסה הגבוהה מודגמת כאן עם קריאות לחץ של 1.2 ו-5.3 millibar. ספקטרום המסות עבור הלחץ הגבוה מוצג כאן בצורה מורחבת.

להלן דוגמה לספקטרומטריית מסות של קומפלקס וריאנט של לקטין, המניבה התפלגות מצבי מטען בין 3000 ל-5,000 ביחס המטען הראשי. עם זאת, בשל התפזרות הולמת של היונים, הפסגות רחבות. העלאת מתח ההטיה מארבעה וולטים ל-15 וולטים, המביאה להגברת תנאי ההאצה, גורמת להסרה של שאריות מים ורכיבי בופר, ובכך מניבה ספקטרום בעל רזולוציה גבוהה; המסה שנמדדה תואמת לקומפלקס פנטמרים.

מצב המטען +15 נבחר לאחר מכן לניתוח MS בתנדם. העלייה באנרגיית ההתנגשות גורמת לשחרור מונומר בעל מטען גבוה המרוכז ביחס מסה-מטען של 1,664 וקומפלקס טטראמרי שעבר פילוף בטווח של 5,000 עד 8,000 ביחס מסה-מטען. קומפלקס הווריאנט של הלקטין נבדק גם בתנאים דנטורנטיים שהובילו לאסוציאציה של הקומפלקס.

בדרך זו, ניתן לקבוע את המסה המדויקת של תתי-היחידות הבודדות המרכיבות את הקומפלקס. הראינו לכם כעת כיצד לרכוש ספקטרום MS וספקטרום MS tandem של יונים בעלי מסה גבוהה. בעת ביצוע הליך זה, חשוב להכין את הדגימה כראוי ולהשתמש אך ורק בבופרים נדיפים התואמים לספקטרומטריית מסה.

זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.