מכשיר microfluidic לכימות Chemotaxis חיידקים Gradients ריכוז אורווה
19 באפריל 2010
פרוטוקול זה מתאר את הפיתוח של המכשיר microfluidic לחקירת chemotaxis חיידקים הדרגתיים ריכוז יציב של chemoeffectors.
חיידקי E Coli RP 4 37 מוכנסים למכשיר כימותקס (כימוטקסיס), שבו הם נחשפים למדרג ריכוזים מרחבי מוגדר. תאים הנכנסים לתא נתקלים בנקודת האמצע של מדרג הריכוזים. בהתאם לשאלה האם האות נתפס כמושך או כדוחה, החיידקים נעים במהירות למעלה או למטה במדרג הריכוזים.
שלום, אני דרק אנגלר מהמעבדה לביוטכנולוגיה של מערכות מולקולריות וממחלקת להנדסה כימית באוניברסיטת Texas A&M. היום נציג בפניכם פרוצדורה לבדיקת כימותקסיס חיידקי במכשיר מיקרופלואידי. אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדותינו כדי לחקור כיצד *E. coli* RP 4 37 ננדירה במדרג ריכוזים של nickel sulfate.
אם כך, נתחיל. השכבה הפלואידית ושכבת הבקרה מיוצרות על ידי יציקה משכפלת של Polymethyl SUBOXANE או PDMS מהתבנית של SU eight. כדי להתחיל בהליך זה, ערבבו את הפולימר המקשר (pre polymer) של ה-PDMS ואת חומר הקישור (crosslinker) ביחס משקלי של 10 ל-1.
בצעו ניקוי בועות (Degas) לתערובת בתוך מתבן למשך שעה אחת עד להסרת בועות האוויר. כאשר תערובת ה-PDMS מוכנה, הניחו את תבנית המאסטר של ה-SU eight בתוך צלחת פטרי ושפכו בזהירות את התערובת מעל תבנית המאסטר של ה-SU eight עד לעובי הרצוי. חממו את צלחת הפטרי המכילה את ה-PDMS ואת תבנית המאסטר של ה-SU eight בטמפרטורה של 80 degrees Celsius למשך שעתיים כדי להקשות (cure) את ה-PDMS.
לאחר שעתיים, הסירו את ה-SU-8 המאסטר המכוסה ב-PDMS שעבר פילמור מהפלטה החמה וקלפו את תבנית ה-PDMS מה-SU-8 המאסטר. המבנה הרצוי יהיה מוטמע בתבנית ה-PDMS; באמצעות מחט בעלת קצה קהה במידה 20 gauge, נקבו ארבעה חורים בתבנית ה-PDMS עבור הצינוריות למחולל המדרג (gradient generator), לכניסת התאים ולשלב היציאה של התאים. כעת אנו מוכנים להרכיב את התקן ה-PDMS כדי לבצע איחוי (bonding) של התקן ה-PDMS.
ראשית, נקה זכוכית של שקופית מיקרוסקופ באמצעות איזופרופנול וייבש אותה באמצעות Airstream. לאחר מכן, חשוף את תבנית ה-PDMS ואת שקופית הזכוכית לפלזמה של חמצן במכשיר plasma etcher למשך כ-30 שניות. הבא את תבנית ה-PDMS למגע עם שקופית הזכוכית. חמם את השקופית ואת תבנית ה-PDMS במגע על פלטה מחממת בטמפרטורה של 65 °C למשך 15 דקות.
להרכבת התקן ה-PDMS, השתמשו בלהב תער כדי לחתוך את הצינורית בזווית של 45 מעלות לאורך המתאים, בהתאם להגדרות המיקרוסקופ. לאחר מכן, בעזרת פינצטה, הכניסו קצה אחד של הצינורית לאחד מארבעת החורים שננקבו בהתקן.
הכנס מחבר מחט קהה בכיול 30 G לקצה השני של הצינורית. חזור על הכנסת הצינורית ומחבר המחט עבור כל שאר החורים. טען 1 mL של chemo taxes, באפר או CB למזרק של 3 mL.
יש להקפיד להוציא את האוויר מהמזרק. הוסף CB למחבר מחט היציאה באמצעות פיפטה והקש על מחבר המחט כדי להוציא בועות אוויר. דחוף כמות קטנה של CB מקצה המזרק בנפח של שלושה מיליליטר וחבר את המזרק למחבר המחט ללא כליאת אוויר.
הדחפו את ה-CB דרך המכשיר עד שכל שאריות נקיבי המחטים יתמלאו ב-CB. פעולה זו אמורה להסיר את מרבית בועות האוויר. לאחר מכן, מלאו שתי מזרקים של 500 microliter ב-CB המכיל את הריכוזים המתאימים של ה-chemo effector הנבדק.
מנעו היווצרות בועות אוויר על ידי דחיפה של טיפה קטנה מתכולת המזרק, כך שתגע בטיפות הנוזל שבבסיס המחט, ואז חברו את המזרק כדי להכין חיידקים בעלי ניידות גבוהה. עבור ניסוי הכימוטקסיס, גדלו תרבית לילה של e coli RP 4 37 עם פלסמיד לביטוי GFP במצע tripton broth או TB בטמפרטורה של 32 degrees Celsius עם ניעור. למחרת, השתמשו בתרבית הלילה כדי להחדיר אותה לתרבית של 20 milliliter של TB בבีกר ארלנמאייר בנפח 250 milliliter, עד לצפיפות אופטית ב-600 nanometers של כ-0.05.
גדלו את התרבית בטמפרטורה של 32 degrees Celsius עם ניעור כאשר התאים נמצאים ב-OD 600 של כ-0.35 עד 0.45. קצרו אותם באמצעות סנטריפוגציה במהירות נמוכה והשעו מחדש את התאים ל-OD 600 של כ-0.35 ב-CB המכיל את האפקטור הכימי בריכוז הצפוי במרכז התעלה. לבסוף, הוסיפו תאים מתים המסומנים ב-RFP ב-OD 600 של כ-0.35 לתאים חיים המבטאים GFP.
תאים מתים אלו ישמשו כביקורת פנימית כדי להבטיח שכל נדידה אינה נובעת מהשפעות זרימה. תרחיף התאים מוכן כעת להעמסה אל תוך ההתקן המיקרופלואידי עבור ניסוי הכימוטקסיס. כדי להתחיל את ניסוי הכימוטקסיס, הסר חלק מה-CB ממרכז מחט כניסת התאים ומלא אותו מחדש בתרחיף התאים.
מלאו בעדינות מזרק של 50 µL בתאים שהושעו מחדש. בצעו זאת לאט, שכן שוטים עלולים להיגזז, דבר שיפחית את הניידות. חברו את המזרק של 50 µL למחבר מחט הכניסה כפי שהודגם קודם לכן, על ידי דחיפה של טיפה קטנה מתכולת המזרק, נגיעה של הטיפה בנוזל שבמחבר המחט וחיבור המזרק. מקמו את המכשיר על השולחן של מיקרוסקופ פלואורסצנציה המצויד במצלמהומהירה לרכישת תמונות.
הכנס את שתי מזרקי הכניסה למשאבת המזרקים והפעל את הזרימה כך שייווצר המדרג (gradient) ותאים יזרמו דרך הפיתוליות. לאחר שהתאים נכנסים לתא הכימוטקסיס, המתן כ-20 דקות לייצוב המערכת. לפני הצילום, אסוף תמונות פלואורסצנציה של תאים חיים (בירוק) ותאים מתים (באדום) במיקומים שונים לאורך התא.
בדרך כלל אנו אוספים 100 תמונות בכל מיקום במרווחי זמן של שלוש שניות. ניתן לנתח את תמונות הפלואורסצנציה שהתקבלו באמצעות כל תוכנה לניתוח תמונות הזמינה מסחרית, כגון Image J או metamorph, או באמצעות קודים פשוטים שנכתבו ב-matlab. בדוגמה זו, נשתמש בקודים של MATLAB.
התחילו בהסרת פיקסלי הרקע בתמונה באמצעות הגדרת סף עצימות הפיקסלים, והסירו את כל הפיקסלים בעלי עצימות הנמוכה מהסף. פעולה זו מצמצמת את הרעש. בניתוח, השתמשו במיקומם של התאים המתים כדי לקבוע את מרכז התמונה.
זה מייצג את המיקום שבו התאים נכנסו לתא הכימותקסיס (chemotaxis) ואת המיקום שבו הם היו מזוהים בהיעדר נדידה כלשהי. לאחר מכן, אתרו תאים חיים בתמונה, חלקו את התמונה לערוצים וקבעו את מספר התאים החיים בכל ערוץ. בעבודתנו הקודמת, תא הכימותקסיס ברוחב 50 µm חולק ל-64 ערוצים שרוחבם היה כ-16 µm כל אחד.
לאחר חזרה על שלבים אלה עבור כל התמונות, סכמו את סך מספר התאים עבור כל ערוץ בכל התמונות. פעולה זו תספק את סך מספר התאים שזוהו בכל ערוץ לאורך משך הניסוי. חשבו את מקדם המשיכה הכימית (chemotaxis partition coefficient או CPC), המייצג את כיוון הנדידה.
על ידי ביצוע השלבים הבאים, הקצו מכפיל של פלוס אחת לכל תא הממוקם בצד בעל הריכוז הגבוה (ימין) ומכפיל של מינוס אחת לכל תא בצד בעל הריכוז הנמוך (שמאל) של התאים המתים. סכמו את כל הערכים המוכפלים ונרמלו אותם למספר הכולל של התאים שזוהו. חשבו את מקדם נדידת הכימוטקסיס, או CMC, השוקל את נדירת התאים לפי המרחק שעברו.
לתא שנע לעמדה בעלת הריכוז הגבוה ביותר בערוץ 64 ניתן מקדם שקלול של פלוס 1, בעוד שלתא שנע עד מחצית הדרך לצד בעל הריכוז הגבוה ניתן מקדם שקלול של פלוס 0.5. תא שנע לעמדה הרחוקה ביותר בעלת הריכוז הנמוך מקבל שקלול של מינוס 1. סכום כל ספירות התאים המשוקללות מנורמל למספר התאים כדי להפיק את ה-CMC.
גרף זה מציג מדרג ריכוזים ליניארי או פרופיל שנוצר במכשיר המיקרופלואידי באמצעות fluorescein isothiocyanate. היווצרותו של מדרג ריכוזים מודגמת בדמות זו באמצעות צבעים בכחול ובצהוב. כניסת התאים הייתה סגורה (CA) כך שלא הייתה דרכה זרימה, וניתן לראות כי נוצר טווח של צבעים בין כחול לצהוב.
להלן תמונות בצבעי פסאודו (pseudocolor) מניסוי כימוטקסיס מייצג, שבו חיידקי e coli RP 4 37 נחשפו במכשיר למדרג ריכוזים של 0 עד 100 µM L aspartate או 0 עד 225 µM nickel sulfate. נדידתם של חיידקים חיים בצבע ירוק לעבר L aspartate או הרחקא מ-nickel צולמה בכל 2.5 שניות במשך 30 דקות. חיידקים מתים, המוצגים באדום, שימשו כביקורת להשפעות זרימה במכשיר.
הפיזור המרחבי של RP 4 37 במכשיר המיקרופלואידי בהיעדרו של מדרג ריכוזים מוצג בגרף זה בהשוואה לתגובתו למדרג ריכוזים של אספרטט ולמדרג ריכוזים של ניקל סולפט. הרגע הדגמנו כיצד לנטר את הכימותקסס של e coli RP 4 37 במדרג ריכוזים של ניקל סולפט. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לצמצם את השקיפה (vortexing) של התאים כדי שניתן יהיה להשתמש בתת-אוכלוסייה בעלת ניידות גבוהה.
זה הכל. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר את הפיתוח של התקן מיקרופלואידי לחקירת כימוטקסיס חיידקי במדרגי ריכוז יציבים של כימו-אפקטורים. חיידקי E. coli RP 4 37 מוחדרים להתקן כדי ללמוד את תנועתם בתגובה למדרגי ריכוז מרחביים מוגדרים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מיקרופלואידיקה
- כיmotaksיה חיידקית
- ביוטכנולוגיה
רקע
- כימוטקסיס חיידקי הוא תנועה של חיידקים לעבר גירויים כימיים או הרחק מהם.
- מכשירים מיקרופלואידיים מאפשרים בקרה מדויקת של מדרגי ריכוז כימיים.
- הבנת כימוטקסיס ( chemotaxis) יכולה לספק תובנות לגבי התנהגות חיידקים ויישומים בביוטכנולוגיה.
- מחקר זה מתמקד ב-E. coli RP 4 37 ובתגובתו לניקל סולפט.
מטרת המחקר
- פיתוח התקן מיקרופלואידי לחקר תנועת חיידקים.
- בדיקת התגובה של E. coli למדרגי ריכוזים שונים.
- העמקת ההבנה של מנגנוני כימוטקסיס בחיידקים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- תכנון וייצור של התקן מיקרופלואידי.
- החדרת E. coli אל תוך ההתקן.
- תצפית על תנועת חיידקים בתגובה למשפיעי כימיה (chemoeffectors).
- ניתוח דפוסי נדידה במעמקי מפל ריכוזים.
תוצאות עיקריות
- חיידקים מפגינים תנועה מכוונת לעבר חומרים מושכים ומרחיקים מחומרים דוחים.
- מסיפי ריכוז מוגדרים משפיעים באופן משמעותי על התנהגות חיידקים.
- ההתקן המיקרופלואידי מספק סביבה מבוקרת לחקר כימותקסיס.
- התוצאות תורמות להבנת המנגנונים של ניווט חיידקי.
מסקנות
- ההתקן המיקרופלואידי שפותח יעיל לחקר כימותקסיס של חיידקים.
- הממצאים מעמיקים את הידע על התנהגות E. coli בתגובה לאותים כימיים.
- למחקר זה יש השלכות על יישומים בביוטכנולוגיה המערבים חיידקים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
כימות של כימוטקסיס חיידקי במדרגי ריכוז יציבים מאפשר הפחתת סיכונים מכניסטית של תיקוף מטרות אנטימיקרוביאליות, על ידי קישור בין חישוף למולקולות כימו-אפקטוריות לבין התנהגות פנוטיפית. גישה מיקרופלואידית זו תומכת בביטחון חזוי בזיהוי מובילים (lead identification) באמצעות אספקת נתוני נדידה כמותיים וניתנים לשחזור תחת תנאים כימיים מבוקרים. הפלטפורמה מגבירה את הרצף התרגומי מסריקת מטרות להערכה פרה-קלינית, על ידי סטנדרטיזציה של מדדי כימוטקסיס עבור צוותים רב-תחומיים.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן היפותזות טיפוליות על ידי מדידת נדידה חיידקית לעבר או הרחק מכימואפקטורים ספציפיים.
- ערך תפעולי: מאפשר תיקוף פונקציונלי של מטרות באמצעות הערכה כמותית של תגובות למשיכים ודוחים.
- ערך מדעי: תומך ברמת הביטחון בניבוי על ידי יצירת מתאם בין התנהגות כיmotקטית לבין ביטוי גנים או פעילות של מסלולים.
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: מכין מערכות חיידקיים מתוקפות לסריקה המשכית על ידי קביעת תגובתיות כימוטקטית בסיסית.
- ערך תפעולי: מבטיח סטנדרטיזציה ושחזוריות של הבדיקה באמצעות יצירת מדרג דיפוזיבי יציב.
- ערך מדעי: מספק תוצאות כמותיות, כגון מקדמי חלוקה ונדידה כימוטקטית, לצורך הערכת תרכובות.
מחקר תרגומי ו-Preclinical
- ערך מדעי: תואם מערכות רלוונטיות למחלה על ידי מידול של ניווט חיידקים בסביבות כימיות דמויות מאחסן.
- ערך תפעולי: מספק רציפות משלב הגילוי ועד לאימות פרה-קליני באמצעות פורמט מיקרופלואידי עקבי.
- ערך מדעי: תומך בהחלטות קידום מותאמות סיכון על ידי כימות הפחתת סיכונים כימוטקטית של מטרות.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד (Pipeline)
המכשיר משתלב בתהליכי עבודה של שלבי הגילוי המוקדמים על ידי מתן אפשרות לבדיקת השערות לגבי אינטראקציות בין כימואפקטורים לרצפטורים לפני אופטימיזציה של המולקולה המובילה.
- ביולוגיה של הגילוי: תומכת בהבהרת מסלולים על ידי קישור דפוסי נדידה למנגנוני זיהוי ספציפיים של כימואפקטורים.
- סריקה: מספקת מוכנות לבדיקה באמצעות יצירת מדרג ריכוזים יציב ותאימות לדימיון במהירות גבוהה.
- אנליטיקה: מייצרת מקדמים כימותקטיים מנורמלים המאפשרים השוואה של תגובות חיידקיות בין תנאים שונים.
- מחקר תרגומי: מקשר לרצף פרה-קליני באמצעות סטנדרטיזציה של מדדי התנהגות חיידקית במערכות מודל שונות.
- שימוש חוזר ארגוני: משמש כפלטפורמה לשימוש חוזר לסריקת כימואפקטורים וזני חיידקים מגוונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף המטרה על ידי הפחתת העמימות בתגובות התנהגותיות של חיידקים.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות והיכולת להרחבה (scalability) באמצעות ייצור מיקרופלואידי סטנדרטי ובקרת מדרג (gradient control).
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות לגבי המשך הפיתוח (go/no-go) על ידי אספקת נתונים כמותיים של כימותקסיס לצורך תיעדוף מטרות.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר קידום מותאם סיכונים על ידי זיהוי מטרות בעלות מנגנוני בריחה כימותקטיים מינימליים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בהרכבת התקני מיקרופלואידיקה, מיקרוסקופיה פלואורסצנטית וניתוח תמונות.
- תלוי ביציקת PDMS, קישור בפלסמה ותשתיות משאבות מזריקים ליצירת גרדיאנט.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של ריכוזי chemoeffectors ופרוטוקולים של סגמנטציית תעלים.
- כולל שיקולי התאמה עבור זנים חיידקיים שונים, סמנים פלואורסצנטיים ומסיסויות של chemoeffectors.
- מוגבל על ידי הצורך לצמצם את מאמץ הגזירה במהלך טעינת התאים כדי לשמר את שלמות השוטונים ואת התנועתיות.
