התקן Gradient מניבות Microfluidic עבור ביולוגיה של התא

שמי ג'יאנג. אני עמית פוסטר ב-Harvard וב-MIT Health, science and Technology. ושמי אמיר מנצ'י ואני סטודנט לתואר ראשון במעבדה של פרופסור ha SANE ב-Harvard, MIT, division of Health Sciences and Technology.

שקופית זו מציגה את תרשים התהליך להכנת ההתקן: ביצעתי ציפוי ספין (spin coating) של SUA 50 מעל שכבת אדי סיליקון, ולאחר מכן הנחתי מסיכה מעל אדי הסיליקון, ביצעתי חשיפה ל-uuv ופיתוח. כך ניתן להשיג בסופו של דבר את הפדים הללו על אדי הסיליקון. לאחר מכן ניתן פשוט ליצוק PDMS, לבצע ריפוי (curing) ואפייה, ואז ניקוב קטן, ולאחר מכן ניתן להדביק את ההתקן באמצעות bonding בין התקן ה-PDMS לזכוכית באמצעות פלזמת חמצן.

בסדר, אנחנו נמצאים כעת בחדר המיקרו-פבריקציה בתוך המעבדה, ונבצע התחלה בהכנת מספר שכבות של PDMS. הכוונה ב-PDMS היא למונח המדעי polymethyl siloxane, והוא פולימר אורגני. זהו הפולימר האורגני מבוסס הסיליקון הנפוץ ביותר בשימוש.

מדובר למעשה בתערובת של שני מרכיבים שונים: בסיס אלסטומר סיליקון וחומר מעבדה (curing agent) לאלסטומר סיליקון. היחס הוא 10 חלקים של בסיס לחלק אחד של חומר המעבדה. אנו זקוקים לכ-10 gram של בסיס, ובהתאם לכך נזדקק לכ-1 gram של חומר מעבדה לאלסטומר, ואנסה לערבב את הבסיס ואת חומר המעבדה עד לקבלת תערובת הומוגנית.

אשתמש בפיפטות. כעת, לאחר שהתערובת מוכנה, אני אשפוך אותה על גבי פרוסת הסיליקון. הרעיון הוא שלפרוסות סיליקון אלו יש תבניות בחלקן העליון.

הם למעשה עוזרים לפולימר ה-PDMS הזה לקבל את התבנית, ואנו משתמשים בתבניות הללו כדי ליצור תעלות וחריצים או כל תבנית אחרת שנזדקק לה על הפולימרים הללו. השלב הבא, מכיוון שישנן בועות רבות בתוך התערובת, הוא ניסיון להניח אותה בוואקום כדי למנוע את הופעתן של בועות אלו בתוך הפולימר שלנו. אני אניח את ג'לי ה-PDMS על גבי פרוסת הסיליקון בתוך תא הוואקום.

אני אסגור את התא ואפעיל את הוואקום. לאחר שהבועות ייעלמו, בעוד כדקה או שתיים, נניח אותו בתוך התנור למשך הלילה, בטמפרטורה של כ-70 °C, כדי לגרום להם להתמצק. התבנית שברצוני שתשימו לב אליה היא שלושת המאגרים השונים הללו ליצירת מדרגות ריכוז, כך שיהיה לנו ריכוז אפס בצד אחד וריכוז ספציפי בצד השני, והתקדמות אחידה לעברו; נבצע ניקוב קטן בקצה השני, שישמש במקרה זה כפתח היציאה.

השלב הבא הוא לגזור אחת מתבניות אלו ולהעבירה לתוך צלח פטרי, כאשר פני השטח של התבנית פונים כלפי מעלה. אני מקווה שאתם יכולים לראות את שלוש פתחי הכניסה ופתח היציאה האחד שהסברתי לכם בתבניות אלו. נשתמש במחוררים קטנים עבור פתחי הכניסה על מנת שנוכל להשתמש בצינוריות פוליאתילן, ואשתמש במחוררים גדולים עבור פתח היציאה כדי שתהיה רזרבה של נוזלים.

נתחיל עם הכניסה הראשונה. אבצע חור, באותו אופן גם בכניסה השנייה, וכן חור קטן נוסף עבור השלישית. השלב האחרון הוא ביצוע חור גדול ביציאה.

לאחר שנסייק, נקבל שכבת PDMS, שהיא השכבה העליונה, ואשתמש בשכבת זכוכית נוספת בתחתית. שקף מיקרוסקופי זה ישמש כשכבה התחתונה במכשירים המיקרופלואידיים. כעת אנחנו בחדר המיקרו-פבריקציה, ויש לי שכבת זכוכית אחת ושכבת PDMS אחת ואני מעוניין להצמידם זו לזו.

כעת נשתמש במכשיר הנקרא מנקה פלזמה (plasma cleaner). בתא המכשיר, הפלזמה תסייע בפירוק הקשרים החלשים על פני השטח ותחליף אותם בקבוצות כימיות בעלות תגובתיות גבוהה, ובכך תהפוך את פני השטח להידרופיליים. כעת אקח את תבנית ה-PDMS, שהיוותה את השכבה העליונה והכילה תעלות בפנים, ואסיר את הסרט שהצמדתי קודם לכן כדי למנוע הידבקות אבק לתבנית.

אני אמקם זאת בתוך התא. השלב הבא הוא הוספת שכבת זכוכית, שהיא זכוכית מיקרוסקופ, וזו תהיה השכבה התחתונה שלנו בתוך המכשיר. לכן, אני אמקם גם אותה בתוך התא.

אני סוגר את התא לחלוטין, וברגע שהוא סגור, אני מדליק תחילה את החשמל ואז את המשאבה; נצטרך לחזור למכשיר זה בעוד כחמש דקות. מה שאעשה הוא לכבות את המכשיר. לכן, אכבה תחילה את המשאבה, לאחר מכן את החשמל, ואפתח את התא.

צליל זה נובע למעשה מהלחץ השלילי שהופעל במהלך התהליך בתוך התא. כעת אוציא את השכבות השונות ואחבר אותן יחדיו. מכיוון שהזכוכית היא השכבה התחתונה, אחזיק אותה בידי השמאלית בצורה יציבה, ואקח את שכבת ה-PDMS ואניח אותה מעל שכבת הזכוכית.

מכיוון שהתבניות פונות כעת כלפי מעלה, אהפוך את שכבת ה-PDMS. אבצע זאת על ידי הצמדתה לזכוכית ולאחר מכן לחיצה ביניהן. הן נצמדות בקלות רבה, ואחד היתרונות של תהליך הטיפול בפלזמה הוא חוזק ההדבקה והקביעות.

כך זה נראה בסוף. אז שוב, אלו הן הכניסות שלנו וזוהי היציאה שלי, ואנחנו מוכנים להמשיך לשלב הבא. בישול הסיבים בתוך המכשיר ולאחר מכן הנחה באינקובטור למשך שעה אחת, ולאחר שעה הוצאת דגימה מהאינקובטור, השמה של תרבית הדגים והכנת התמיסה.

להכנת תמיסת ה-EGF, השתמשנו ב-2 mL של מצע גידול Azure, אליו הוספנו 15 ng/mL של EGF ו-10 µM של 50 D; תמיסה זו משמשת להדמיית מדרג EGF לאורך התעלה. לאחר מכן, לקחנו 2 mL של מצע גידול, מצע וירטואלי, והוספנו כאן 2 mL נוספים של מצע גידול. שתי הגדרות אלו הן עבור הזנה רגילה של תרביות במכשיר.

אז אני מסיר את הבועה, מחבר שוב, וגם הפעם בועה ניידת יורדת שוב. לאחר מכן, אני משתמש ב-15 nanogram של EGF ו-10 micromolar של fi dextra ושני mil של מדיה מה-takeout, הדגימה 2, ומכניס את המזרק ואז, כפי שאתם רואים, את הבועה. ואז פשוט מחליף תמיסות, ומחזיר בחזרה.

יש להעביר את התמיסה למזרק מסוג gas type וללחוץ על ה-SH מספר פעמים כדי להוציא את בועות האוויר; ראשית, מעבירים את כל התמיסה במזרק לכאן, ולאחר מכן מסובבים את השסתום כדי שהתמיסה תעבור דרך השסתום התלת-כיווני (threeway bar) ואת הצינורית, עד שהתמיסה תצא מהצינורית. לאחר ערבוב התמיסה ויציאתה, ניתן להכניס את הצינורית למכשיר ה-My Predict, כאשר כל שלוש התמיסות זהות. ניתן לחבר בעדינות את פתח הכניסה של תעלת ההזרקה.

לבסוף, קיימים שני סוגים: מצע תרבית רגיל, ומצע תרבית עם EGF, וזאת כדי לאשש את פרופיל המדרג של EGF. זהו התא ברשת, התא ברשת.

זה יהיה מוצא התאים, כך שייווצר גרדיאנט באמצעות שלושת ערוצי הרכז (hub channels) ולאחר מכן ייווצר הגרדיאנט בתוך אזור התאים. בדרך כלל, מה שאני רוצה לעשות הוא פשוט לבצע השקעה של התאים, השקעה של תרחיף התאים במוצא, ואז ניתן פשוט לבצע שאיבה עדינה פנימה, כך שהתאים יזרמו דרך אזור התאים, ישקיעו באופן אוטומטי ויישקעו על הציפוי, תוך וידוא שהתאים נפרשים לחלוטין. לאחר שווידאנו שהתאים נפרסים לחלוטין, נוכל פשוט להתחיל בהזרמה ואז לחקור את נדידת התאים באמצעות התקן ליצירת גרדיאנט.