לימוד בריכות שלפוחיות Synaptic באמצעות photoconversion של צבעים Styryl
15 בפברואר 2010
צבעים FM כבר סיוע שלא יסולא בפז בהבנת הדינמיקה הסינפטי. FMS אחריהן בדרך כלל במהלך תנאי גירוי שונים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. עם זאת, photoconversion של צבעים FM משולב עם מיקרוסקופ אלקטרונים מאפשר הדמיה של בריכות נפרדות שלפוחית סינפטית, בין הרכיבים ultrastructure אחרות, boutons הסינפטי.
סרטון זה מדגים את הפרוצדורה להמרה פוטוכימית של Styro Dye FM 1 43. כדי לחקור מאגרי שלפוחיות סינפטיות ב-drosophila melanogaster, ראשית מבצעים דיסקציה לזחלי דרוזופילה כדי לחשוף את השרירים הוונטרליים המהווים את הכנת הצומת העצבית-שרירית (NMJ). הדגימות מדוגרות בבופר המכיל FM D, המוצג כאן באפור, המסמן את הממברנה התאית.
לאחר מכן הם מעוררים חשמלית או כימית כדי להשרות איחוי פיזי של ממברנת הווזיקולות שמופנמות בעקבות זאת. אקסוציטוזה מעוררת תיסמן באמצעות FM D. לאחר מכן שוטפים את צבע ה-FM החוץ-תאי, ובכך מסירים אותו מממברנת הפלזמה, והרקמה מקובעת תחת הארה רציפה בעוצמה גבוהה. הצבע עובר הלבנה מלאה, והצבע השחור מופיע עקב שיקוע של di amino Ben.
ניתן להדמות משקע זה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים חודר (TEM). שלום, אני פיליפ או פאסו מהמעבדה של סילביה אולי במכון למדעי העצבים האירופיים בגאון, גרמניה. היום נדגים לכם פרוצדורה להמרת פוטונים של FM בצומת עצבי-שרירי.
אנו משתמשים בנוהל זה במעבדה שלנו כדי לחקור מיחזור של שלפוחית סינפטית. אשרינו, בואו נתחיל. בעבודה תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי, התחילו בהצמדה של זחלי דרוזופילה כאשר הצד הגבי פונה כלפי מעלה בתוך צלחת מצופה ב-so guard.
כסו את הדגימה בתמיסת סלין לדרוזופילה באמצעות מחט של מזרק, ובאמצעות מספרי ניתוח בצעו חיתוך אורכי בצדו הגבי של החרק. לאחר מכן, הסירו את האיברים הפנימיים. בשלב הבא, מתחו את הדגימה והדביקו אותה שוב בסיכות לצלוחית הפטרי.
ניתן להשתמש במספר שרירים ונטרליים כדי להגן על צבעי ה-FM המשמשים בהליך זה מפני הבהרה. יש לבצע הליך זה בתנאי תאורה נמוכים. כסו את דגימת ה-drosophila המקובעת במי מלח drosophila המכילים 90 millimolar potassium chloride ו-10 micromolar FM.1 43 כדי לעורר את העצבים כימית.
דגרו למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר לאחר הגירוי. הסירו את תמיסת הגירוי וטבלו את הצלחת עם ה-drosophila המקובעת, המוכנה בבีกר מלא ב-100 milliliters של סליין ל-drosophila, פעמיים כדי להסיר את צבע ה-FM 1 43 החוץ-תאי, תוך עבודה תחת מנדף בטיחות כימית.
קבע את תכשיר המפגש העצבי-שרירי ב-2.5% glutaraldehyde בתוך phosphate buffered saline או PBS למשך 45 דקות בטמפרטורת החדר. שטוף את התכשיר פעם אחת ב-PBS, לאחר מכן הוצא אותו מכלי הסיגר והטבל אותו ב-100 millimolar ammonium chloride למשך 15 דקות, כדי לנטרל את קבוצות האלדהיד החופשיות של מקבע ה-glutaraldehyde שנותר.
שטפו את תמיסת האמוניום כלוריד באמצעות PBS רגיל, העבירו את תכשיר הצומת העצבי-שרירי לצלחת סיגר חדשה והטביעו אותו ב-1.5 milligram per milliliter של Diamine benzine או DAB ב-PBS, והדגירו למשך 30 דקות בטמפרטורה של four degrees Celsius. מקמו את הדגימה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי המצויד במקור אור של נורת כספית עם בית נורה המכיל מראה אחורית, באמצעות עדשה יבשה בעלת הגדלה נמוכה יחסית.
אתר את הדגימה. לאחר מכן, באמצעות קוביית פילטרים רגילה לעירור כחול ופלואורסצנציה ירוקה, הבא את אות הפלואורסצנציה למצב פוקוס. הצמתיות העצביות-שריריות (neuromuscular junctions) יופיעו כנקודות בהירות על השרירים.
בשלב הבא, תוך שימוש באותה מערכת מסנני פלואורסצנציה, האירו את הדגימה בעוצמה מרבית עד שה-FM D ילבן לחלוטין. בשימוש בעדשה אובייקטיבית של 20x, זמן של 30 עד 45 דקות אמור להספיק. עם זאת, משך הזמן להמרה פוטוכימית משתנה בהתאם לעוצמת ההארה, למידת החדירה של ה-DAB אל התכשיר ולסוג העדשה האובייקטיבית שבה נעשה שימוש.
לאחר ההארה, יש לבחון את הדגימה תחת אור תמסורת (transmission light). אם התרחשה המרה פוטוכימית, אמור להופיע משקוף חום כהה. חזור למיקרוסקופ הדיסקציה, ולאחר מכן השתמש במספריים כדי לגזור את הנקודה שעברה המרה פוטוכימית מהזחל.
חזרו למיקרוסקופ הדיסקציה. לאחר מכן, השתמשו במספריים כדי לגזור את הנקודה שהומרה בתמונה מהזחלים. כעת, העבירו את הדגימה לשפופרת מיקרו-צנטריפוגה המכילה PBS, תוך עבודה תחת מנדף בטיחות כימית ובשאיפת ציוד בטיחות מתאים, כולל כפפות והגנת עיניים.
הכינו 300 µL של אוסמיום טטראוקסיד 1% לכל דגימה. כעת, הניחו את הדגימה בתוך בקבוק זכוכית עם פקק פלסטיק והוסיפו את תמיסת האוסמיום טטראוקסיד שהוכנה לצורך קיבוע משני של הדגימה. בזמן שהדגימה עוברת אינקובציה, הכינו תמיסות נפרדות המכילות ethanol בריכוזים של 30, 50, 70, 90, 95 ו-100%.
שטפו את הדגימה ארבע עד חמש פעמים עם PBS למשך חמש דקות בכל פעם. לאחר כל שטיפה, השתמשו ב-PEs פלסטיקי עבור הפיפטה שלכם כדי להעביר את הדגימה לבקבוק חדש. לאחר השטיפה האחרונה, העבירו את הדגימה לבקבוק זכוכית נקי.
בשלב הבא, יש לבצע דהידרטציה לדגימה על ידי הנחתה בסדרת תמיסות אתנול. התחל בהדגרה ב-1 mL של 30% ethanol. לאחר חמש דקות, הסר את האתנול באמצעות פיפטת פסטור והחלפה אותו ב-1 mL של 50% ethanol.
המשך בתהליך ההתייבשות, על ידי דגירה של דגימת המעבר העצבי-שרירי בתמיסות של 70%, 90% ולאחר מכן 95%. לאחר מכן, דגרי את הדגימה בתמיסת אתנול 95% למשך זמן ממושך יותר מאשר בדגירה בתמיסת אתנול 100%, שבוצעה שלוש פעמים לאחר ההתייבשות. הוסף שני מיליליטר של שרף EIN ביחס של 1:1 לאתנול והנח את הדגימה לדגירה ברוטטור.
שעתיים עד ארבע שעות בטמפרטורת החדר לאחר סיבוב ב-100%ein והנחת הדגימה בבקבוק פתוח כדי לאפשר לאתנול שנותר להתאדות במשך ארבע עד שש שעות. יש למזוג EIN טרי לתוך תבנית. הוסף את התכשירי ההכנה והדגר בטמפרטורה של 60 °C למשך 36 שעות.
כאשר תכשירים המוטמעים ב-EIN מוכנים, השתמש במיקרוטום אולטרה (ultra microtome) כדי להכין חתכים דקים בעובי של 50 עד 80 nanometer באמצעות סכין יהלום. הדגימות נחתכות לחתכים דקים. החתכים צפים על אמבט המים של הסכין וניתן לאסוף אותם לאחר מכן על גבי רשתות EM סטנדרטיות.
הדגימות מוכנות כעת לדימוי באמצעות פרוצדורות EM קונבנציונליות. צמתים עצביים-שריריים שהבודדו מ-Drosophila Melan gaster עוברו בגירוי באמצעות ריכוז גבוה של אשלגן, וממברנות שהופנמו נצבעו באמצעות FM 1 43 כפי שמוצג כאן.
ניתן לתצפת על הפלואורסצנציה של קצה עצב באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה אפי (epi) קונבנציונלי. תחת הארה רציפה, הצבע עובר הבהרה (bleaching) מלאה, וכאשר ההארה נמשכת, מופיע צבע שחור עקב שיקוע של dino benzine. קצה עצב זה מכיל שלפוחיות סינפטיות, אך אף אחת מהן לא עברה המרה פוטו-כימית (photo conversion).
ייתכן שהדבר נגרם מחוסר בתאורה או מחדירה לקויה של DIA amino benzine לרקמה. לעומת זאת, תאורה מרובה מדי גורמת למסוף כהה באופן כללי שבו לא ניתן להבחין בשלפוחיות או באברונים; עם כמות התאורה המתאימה ניתן להבחין בהמרה פוטוכימית. מיקרוגרף זה מראה כפתור סינפטי שבו נראה מאגר של שלפוחיות כהות, המעידות על המרה פוטוכימית של FM.
הרגע הצגנו בפניכם כיצד לבצע המרה פוטוכימית של שלפוחיות סינפטיות המסומנות בצבע fem. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור תמיד לכייל בקפידה את זמני ההארה עבור שלב ההמרה. וזהו זה.
תודה לצפייה. בהצלחה בניסויים שלכם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
סרטון זה מדגים את הפרוצדורה להמרה פוטונית (photoconversion) של צבע Styro Dye FM 1-43 לצורך חקר מאגרי שלפוחיות סינפטיות ב-Drosophila melanogaster. השיטה כוללת דיסקציה של זחלים לחשיפת המצומת העצבי-שרירי, הדגרה בצבע FM ושימוש בהארה בעצימות גבוהה לצורך ויזואליזציה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- דינמיקה סינפטית
רקע
- צבעי FM הם חיוניים להבנת הדינמיקה הסינפטית.
- הם מאפשרים ויזואליזציה של מאגרי שלפוחיות סינפטיות.
- שילוב של צבעי FM עם מיקרוסקופיה אלקטרונית משפר את התובנות המבניות.
- טכניקות של המרה פוטונית חושפות אוכלוסיות וזיקולות מובחנות.
מטרת המחקר
- להדמיית מאגרי שלפוחיות סינפטיות ב-Drosophila.
- להדגמת תהליך הפוטו-המרה של צבעי FM.
- להעמקת ההבנה במנגנונים סינפטיים.
שיטות שהשתמשו בהן
- דיסקציה של פקעות Drosophila לצורך גישה לצומת העצבי-שרירי.
- אינקובציה של הדגימות בתמיסת צבע FM.
- סטימולציה חשמלית או כימית להשראת אקסוציטוזה.
- הארה בעוצמה גבוהה לצורך הבהרה (bleaching) של הצבע והדמיה.
תוצאות עיקריות
- סימון מוצלח של ממברנות תאיים באמצעות צבע FM.
- הדמיה של אירועי היתוך של שלפוחיות לאחר גירוי.
- זיהוי ברור של מאגרי שלפוחיות סינפטיות נבדלים.
- הדגמת יעילות הפוטו-המרה במיקרוסקופיה.
מסקנות
- צבעי FM הם כלים יעילים לחקר דינמיקה סינפטית.
- פוטו-המרה (Photoconversion) משפרת את הוויזואליזציה של מבנים סינפטיים.
- ניתן ליישם שיטה זו במגוון מחקרים סינפטיים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מיפוי מדויק של מאגרי שלפוחיות סינפטיות באמצעות פוטו-המרה של צבעי styryl מאפשר ניתוח ברזולוציה גבוהה של דינמיקת מיחזור שלפוחיות, שלב קריטי בהבנת מנגנוני שחרור מוליכים עצביים. יכולת זו תומכת בהפחתת סיכונים מנגנוניים ובתיקוף מטרות בשלבים מוקדמים של גילוי תרופות במדעי המוח, ומספקת מידע לקבלת החלטות לגבי תיקי פיתוח שבהם תפקוד סינפטי מהווה מיקוד טיפולי. שילוב של קריאות אופטיות ואולטרה-מבניות מגביר את הביטחון החזוי עבור מחקרים תרגומיים בנורו-פרמקולוגיה.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר ויזואליזציה ישירה של מיחזור וסיקולות, ובכך מבהיר את מנגנוני המסלולים הסינפטיים.
- תומך בתיקוף תפקודי של מטרות על ידי קישור דינמיקת הוסיקולות לפעילות נוירונלית.
- מסייע בהפחתת סיכונים מנגנונית עבור מטרות סינפטיות בהפרעות נוירודגנרטיביות ופסיכיאטריות.
- מספק הקשר מבני לבחינה מונחית-היפותזה של התפקוד הסינפטי.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- מבסס תכשירים מאומתים של צומת עצבית-שרירית לצורך סריקת תרכובות בהמשך התהליך.
- מספק תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור של דינמיקת מאגרי הוסיקולות באמצעות פלואורסצנציה ו-EM.
- מאפשר סטנדרטיזציה של הבדיקה להשוואה בין מחקרים ובין אתרים שונים.
- תומך ביכולת הרחבה (scalability) לסריקת מודולטורים סינפטיים במודלים פרה-קליניים.
מחקר תרגומי וטרום-קליני
- מתאימה את מדידות מאגר הוסיקולות למודלים של תפקוד סינפטי לקוי הרלוונטיים למחלה.
- מספקת רציפות ממחקרי מנגנונים בשלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני של מטרות סינפטיות.
- מנחה קידום מותאם-סיכון של מועמדים המשפיעים על מסלולי שחרור מוליכים עצביים.
- משפרת את הערך הניבוי לפיתוח ביומרקרים תרגומיים בהפרעות של מערכת העצבים המרכזית (CNS).
שילוב תהליכי עבודה ומסלולי עיבוד
שיטת פוטו-המרה זו מגשרת בין שלבי הגילוי המוקדמים למחקר הפרה-קליני על ידי כך שהיא מאפשרת ניתוח כמותי וישיר של דינמיקת שלפוחיות סינפטיות במערכות מודל.
- ביולוגיה של תגליות: תומך בבדיקת השערות ובבירור מסלולים עבור מטרות סינפטיות.
- סריקה: מספק מדידות כמותיות הניתנות לשחזור של מאגרי שלפוחיות לצורך פיתוח בדיקות.
- אנליטיקה: מספק נתוני קריאה מבניים ותפקודיים ברזולוציה גבוהה לצורך ניתוח השוואתי.
- מחקר תרגומי: מקשר בין ממצאים מכניסטיים למודלים רלוונטיים למחלה ואסטרטגיות של סממנים ביולוגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע זרימת עבודה הניתנת לשימוש חוזר לניתוח שלפוחיות סינפטיות במספר תוכניות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף של מטרות סינפטיות.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של ניתוח מאגרי שלפוחיות לצורך הדירות ויכולת הרחבה.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת החלטות go/no-go ואת הקצאת ההון עבור פורטפוליו של מערכת העצבים המרכזית (CNS).
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף מותאם סיכון של תוכניות למטרות סינפטיות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במיקרוסקופיה פלואורסצנטית, מיקרוסקופיה אלקטרונית ודיסקציה נוירו-אנאטומית.
- מחייב גישה למקורות תאורה בעצימות גבוהה ולתשתית EM.
- מצריך סטנדרטיזציה קפדת בין צוותים של פרמטרי הגירוי והפוטו-המרה (photoconversion).
- ייתכן שיהיה צורך בהתאמות עבור אורגניזמי מודל או מערכות סינפטיות שונות.
- יעילות הפוטו-המרה רגישה לכיול התאורה ולחדירות הרקמה.
שאלות נפוצות בביו-פארמה
Chapters in this video
0:00
Title
0:57
Introduction
1:24
Preparation of Drosophila melanogaster Neuronal Muscular Junction (NMJ)
2:05
Stimulation and FM Staining
2:43
Fixing Neuromuscular Junction Preparations
4:49
Processing the Sample for Electron Microscopy
7:29
Representative Results
3:19
Photoconversion of FM1-43
8:19
Conclusion
