ניתוח Synaptic אפנון של

המטרה הכוללת של הליך ניסיוני זה היא להבין את הדינמיקה הסינפטית בנוירון בודד תחת תנאי הפעלה שונים. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הפלסטיות הסינפטית, כגון חשיפת שינויים בהרכב המולקולרי של סינפסות בעקבות הבשלת פעילות הנוירון. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת ניתוח חצי-אוטומטי של היבטים מרובים של סינפסות, כולל מספרן, התפלגותן ורמת ההעשרה של מרכיבים מולקולריים בסינפסות.

עבור ניסוי זה, אספו את הזבובים למבחנות רגילות בתוך שש שעות מהבקיעה (eclosion). הכניסו את מבחנות האיסוף למעמד אקרילי שקוף. בתוך דגרה קטנה המכוון ל-25 °C, מקמו את המעמד במרחק מדויק מפאנל LED שבו החשיפה לאור היא בממוצע 1000 lux.

לאחר מכן, גדלו את הזבובים למשך יום אחד עד שלושה ימים תחת אחד מהתנאים הבאים: חשיכה קבועה, 12 שעות אור ולאחריהן 12 שעות חשיכה, או אור קבוע. בשלב מאוחר יותר, בצעו דיסקציה וצביעה של המוחות באמצעות טכניקות סטנדרטיות. כדי להכין את מוחות הזבובים למשקף, טענו מיקרופיפט במדיום קיבוע והניחו שתי טיפות של 2 µL במרכז של סמיכה למסננת (microscope slide), במרחק של כ-2 cm אחת מהשנייה.

הניחו זכוכית כיסוי על כל טיפה, כך שהמרווח יהיה כ-0.2 mm. לאחר מכן, טפטפו 15 µL של תמיסת קיבוע (mounting medium) מעל זכוכיות הכיסוי ועד למרווח. תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי (dissecting microscope), העבירו את המוח אל תוך המרווח באמצעות מיקרופיפט.

לאחר מכן, מקמו את המוחות כאשר הצד הוונטרלי (בטני) פונה כלפי מעלה. לבסוף, הצמידו כיסוי זכוכית (cover slip) ואטמו אותו לאורך הקצוות באמצעות לק שקוף. לאחר מכן ניתן לצלם את המוחות בטכניקות סטנדרטיות לשחזור תמונות בתלת-ממד.

במקרה זה, לומניסנציית GFP תועדה בתאים בעלי ביטוי פעיל של Brp באמצעות שיטת ה-star. כמו כן, בדוגמה זו, אקסונים של פוטורספטורים R7 ו-R8 סומנו אימונולוגית באמצעות anticiaoptin, אשר נצפה באמצעות נוגדנים משניים המסומנים ב-RFP. כדי לכמת את מספרן, את פיזורן ואת רמת הדלוקליזציה של נקודות (puncta) ה-Brp GFP, טענו תחילה תמונות תלת-ממדיות משוחזרות של המוח שנוצרו מערימות תמונות.

נקודות Brp מוצגות בלבן. כעת, אתרו את אזור העניין. במקרה זה, קצות האקסונים של R8 ממוקמים על ידי מעקב אחר ההדקה של האקסונים החיוביים לאנטיסיאופטין בנקודת הכניסה לשכבת ה-M3 של המדולה.

בכל קצה של אקסון R8 זהה את נקודות ה-Brp GFP באמצעות מודול זיהוי הנקודות (spot detection). בחר ב-"add new spots" ולאחר מכן בחר ב-"segment only region of interest" בהגדרות האלגוריתם. לאחר הגדרת אזור הניתוח, הגדר את ערוץ המקור ל-Brp GFP ולאחר מכן הגדר את הקוטר המוערך ב-XY ל-0.35 microns.

לאחר מכן, סמנו את אפשרות החסרת הרקע (background subtraction) בזיהוי הנקודות (spot detection). בשלב הבא, בחרו ב"איכות" (quality) כסוג המסנן, והפונקטה (puncta) יסוננו באופן אוטומטי. השלימו שלב זה על ידי לחיצה על סיום (finish).

חזור על שיטת זיהוי הנקודות עבור כל אקסוני ה-R8 במערך הנתונים. האזור הבא שיש לזהות הוא הציטופלזמה של האקסון. ראשית, צור אובייקטים של פני שטח באמצעות פונקציית surface.

לאחר מכן, בחרו בתוספת משטחים חדשים (add new surfaces), ותחת הגדרות האלגוריתם, הפעילו את האפשרות לביצוע סגמנטציה של אזור העניין בלבד (segment only region of interest). כעת, בחרו ידנית את אזור העניין. לאחר מכן, הגדירו את פרמטרי החישוב.

כדי למצוא את תעלת הפטורצפטור כמקור, בחרו באפשרות smooth. עבור הסף, בחרו ב-absolute intensity. הפעילו את האפשרות split touching objects.

הגדירו את קוטר נקודות המגע (seat points) ל-0.5 microns והשתמשו בהגדרות המסנן ברירת המחדל עבור האיכות ומספר הווקסלים (voxels). המסנן יוחל לאחר מכן באופן אוטומטי. כעת, עבורו לעריכה ומחקו את חלקי הפני השטח שנוצרו מחוץ לאזור העניין (region of interest).

במקרה זה, שאר האקסונים. לאחר חזרה על זיהוי אזור האקסון עבור כל אקסוני ה-R8 במערך הנתונים, כל נקודות ה-Brp ואקסוני ה-R8 מזוהים כסט של אובייקטי נקודות (spot objects). והאזורים הציטופלזמיים התואמים מזוהים כאובייקטי שטח (surface objects).

כעת, המשיכו להגדיר ידנית את הכיוון והמרחב של כל אקסון. שלב זה חשוב לצורך כימות עתידי של צפיפות Brp GFP לאורך כל נוירון בניורופיל של המדולה. כדי לעשות זאת, הגדירו תחילה את נקודות ההתחלה והסיום שלהם.

בחרו באפשרות להוספת נקודות מדידה חדשות (add new measurement points), לאחר מכן בחרו בעריכה (edit) ואז בבחירת פני השטח של האובייקט (select surface of object) כדי לעבוד עם החלק העליון של אובייקטי פני השטח. כדי להגדיר את נקודות ההתחלה, מקמו נקודות מדידה על כל אובייקטי פני השטח של ה-R axons בשכבת ה-M1. מקמו נקודות אלו בסדר שיטתי הניתן לשחזור.

בשלב הבא, הגדירו את נקודות הסיום. בחרו ב-"add new measurement points", "edit" ושוב ב-"surface of object". לאחר מכן, תוך חזרה על אותו סדר שיטתי, הניחו נקודות מדידה בחלק התחתון של אקסוני ה-R בשכבה M3.

כדי לכמת את עוצמת הרקע של Brp, נתחו את האזורים הציטופלזמיים של שני אקסונים של R7. בחרו באפשרות להוספת משטחים חדשים (add new surfaces) והגדירו ידנית את האזור של אקסון R7 כפי שנעשה עבור אקסוני R8. השתמשו בהגדרות זהות, למעט אפשרות ה-enable split touching objects, אותה אין להפעיל.

השאר זאת כבוי. כעת, הוסף אובייקט נקודות דמי (dummy spots) בתוך אזור ציר אקסון R7 מוגדר. בחר באפשרות הוסף נקודות חדשות (add new spots), בחר בדלג על יצירה אוטומטית (skip automatic creation), וערוך ידנית.

לאחר מכן, בחרו ב-center of object ולחצו על ה-surface object כדי למקם את ה-dummy spots object בתוך ה-R7 axon. כעת, חזרו על שלבי זיהוי השטח והנקודות עבור R7 axon שני. לאחר מכן, הגדירו את נקודות הקצה ההתחלתית והסופית של ה-R7 axons כפי שנעשה עם ה-R8 axons.

עבור ניתוח זה, ודאו שהתוכנה המתאימה מותקנת. פתחו את מערך הנתונים המכיל את נתוני הנקודות (spot data), נתוני המשטחים (surfaces data) ושני אובייקטים של נקודות מדידה, כאשר כל אחד מהם מכיל את אותו מספר של נקודות מדידה. בחנו את הנתונים.

שני אובייקטי נקודות המדידה חייבים להכיל מספר זהה של נקודות מדידה כדי שהחישובים יעבדו. לאחר הגדרת הנקודות (spots), אזורי האקסון ונקודות ההתחלה והסיום, הפעילו את התוסף. ראשית, בדקו את המטא-דאטה, ובמיוחד את גודל הווקסל (voxel size).

פתחו את מאפייני התמונה (image properties) דרך עריכה (edit), ולאחר מכן בדקו את שלושת ממדי הווקסל (voxel) ואת המיקרונים תחת קואורדינטות (coordinates) בגיאומטריה (geometry). לאחר מכן, בחרו ערוץ לצורך ניתוח העוצמה (intensity analysis). במקרה זה, נבחר הערוץ המציג את Brp GFP.

לאחר מכן, הגדירו את שם הקובץ עבור התוצאות. בשלב הבא, הגדירו את מספר הסלים (bins) כ-10, וקבעו את אורך האקסון ל-100%. לאחר מכן, הגדירו את אזורי הפונקטה (puncta) על ידי קביעת רדיוס הנקודה ל-0.35 microns ואת האזור הציטופלזמי המקיף ל-50 microns. לבסוף, הפעילו את פקודת זיהוי הסינפסים, ובשלב מאוחר יותר, בצעו ניתוח סטטיסטי של הפלט.

בהתאם לפרוטוקולים המתוארים, נותחו נקודות (puncta) של Brp GFP בסינפסות ה-R8 של זבובים שנחשפו לחושך קבוע, לאור קבוע, או למחזור אור/חושך רגיל. מספר נקודות ה-Brp פחת באופן משמעותי בפוטורצפטורים מסוג R8 של זבובים שנשמרו באור קבוע. התפלגות הנקודות חושבה באמצעות תוסף (plugin) מותאם אישית.

סינפסות R8 היו מפוזרות לאורך כל ציר האקסון מהשכבה M1 לשכבה M3, אך צפיפותן הייתה גבוהה יותר בשכבות M1 ו-M3. באופן דומה, חושבו רמות הדילוקליזציה (delocalization) של הפונקטה (puncta). אלו לא השתנו בכל התנאים, אולם רמות הדילוקליזציה של Brp GFP היו שונות ממרקרים אחרים, כגון Brp-short-cherry שנעשה לו מטושטש (defused) באופן ברור תחת תאורה קבועה.

ייתכן שקיימת עיבוד שגוי של מקטע ה-Brp הקצר לאחר הפירוק מה-AZ. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה של האופן שבו מנתחים תכונות פלסטיות סינפטיות בנוירון בודד. תכונות פלסטיות אלו כוללות את מספר הסינפסות, את התהלוכיותן ואת רמת העשרה של רכיב מולקולרי ספציפי בסינפסות.