באמצעות מערכת GELFREE 8100 ההיפוך חלוקה על ההיפוך חלוקה משקל מבוסס מולקולרית עם שלב החילוץ נוזלי

שלום, שמי ג'יי הרקינס. אני מדען מחקר ב-Protein Discovery. היום אדגים כמה קל להשתמש במערכת ה-gel free 8, 100 Fractionation החדשה כדי להשיג פרקציונציה מבוססת משקל מולקולרי עם שיעורי התאוששות גבוהים.

באמצעות GelFree, ניתן להעמיס עד מיליגרם אחד של חלבון כולל לכל ערוץ, ולבצע הפרדה שחזירה של עד שמונה דגימות בתוך כ-90 דקות. המערכת כוללת מכשיר, מחסנית חד-פעמית וכל התמיסות הדרושות לביצוע הניסוי. בואו נתחיל.

התחל את הפרוצדורה על ידי הכנה וסימון של עד שמונה מבחנות בנפח 500 microliter. הוסף עד 1 milligram של דגימת החלבון בנפח של עד 112 microliter. כמות החלבון בדגימה תלויה במורכבות הדגימה.

עבור דגימות מורכבות יותר, כגון הומוגנאט הרקמה ששימש להדגמה זו, 150 עד 200 micrograms לכל תעלה יניבו את התוצאות הטובות ביותר. לאחר מכן, הוסיפו 30 microliters של five x sample buffer, המסופק בערכת ה-gel free cartridge. לכל דגימת חלבון, הוסיפו eight microliters של one molar DTT.

לאחר מכן, השלימו את הנפח של כל דגימה בעזרת מים לנפח סופי של 150 microliters. לאחר מכן, חממו את המבחנות למשך חמש דקות בטמפרטורה של 95 degrees Celsius כדי לדנטור את הדגימה. הניחו לדגימות המחוממות להתקרר לטמפרטורת החדר בזמן שהדגימה מתקררת.

הוצא את מחסנית ה-gel free 8, 100 משקית הפויל. הסר והשלך את אטם הפלטה. הסר את תמיסת השימור מתאי המחסנית באמצעות פיפטה.

אם נעשה שימוש בכל שמונת התאים של המחסנית, הפוך את המחסנית כדי לרוקן את תמיסת האחסון מהתאים. לאחר מכן, הוסף 8 mL של תמיסת הרצה ללא ג'ל לכל אחד ממאגרי תמיסת האנודה. הוסף 6 mL לכל אחד ממאגרי תמיסת הקתודה, וטפטף באמצעות פיפט 100 µL לכל אחד מתאי האיסוף.

באמצעות פפיט שמונה ערוצים של 100 עד 200 µL, הסירו והשליכו כל תמיסת בופר שזרמה ממאגר בופר הקתודה אל תא טעינת הדגימות, וטענו מיד את הדגימות לתאי הטעינה. לאחר טעינת הדגימות, הכניסו את המחסנית לתחנת הפרדה מסוג GelFree 8, 100. לאחר מכן, הורידו את מערכי האלקטרודות וסגרו את המכסה באמצעות ממשק המשתמש הגרפי וקל התכנות במסך המגע של המכשיר, ועברו לרשימת השיטות התכנוניות הזמינות.

בחרו את השיטה המתאימה על ידי לחיצה על כפתור השיטה (method). לחצו על כפתור השליפה (retrieve) והזינו את מספר השיטה המתוכנתת הרצויה. השתמשו במקלדת שעל המסך ולחצו על אישור (okay). לאחר מכן, לחצו על כפתור היישום (apply).

השיטה שהוחלה תופיע בתחתית המסך הראשי. כל אחת מהשיטות המתוכנתות מראש מורכבת ממתחים קבועים והפסקות מבוססות זמן שנועדו להפריד חלבונים בטווח ספציפי של משקלים מולקולריים. לאחר בחירת השיטה המתאימה, לחצו על כפתור הערוץ במסך הראשי.

לאחר מכן, בחרו את הערוצים שבהם תיעשה שימוש בהרצה. כדי לבחור את כל שמונת הערוצים, לחצו על "בחר הכל" (select all). לאחר מכן לחצו על "סיום" (done).

כדי לחזור למסך הראשי, ודאו שמכסה הבטיחות סגור ושנורית החיווי בתחתית המסך היא ירוקה. כעת לחצו על start כדי להתחיל את הניסוי; בעוד המערכת פועלת, העיגולים המוצגים בתיבה בצד שמאל של המסך מתארים את מצבם של הערוצים. עיגול ירוק מעיד על כך שהערוץ פעיל.

המתחים והזרמים המופעלים מוצגים מימין למעגלי מצב הערוץ. ה-gel free 8, 100 יעצור באופן אוטומטי לאיסוף פראקציות במרווחים המוגדרים בשיטה. כאשר המכשיר עוצר לצורך איסוף פראקציות, תופיע תיבת טקסט המהודעת על כך שהתרחשה עצירה ומעגלי המצב יהפכו לצהובים.

בתוך המחסנית, מופעל מתח קבוע בין מאגרי האנודה והקתודה. תחת פוטנציאל זה, תערובת החלבונים נדחפת באופן אלקטרופורטי מתא הטעינה ואל תוך התבנית המדויקת שתוכננה במיוחד. החלבונים נערמים תחילה בתוך פס צר בג'ל הערימה (stacking gel), ולאחר מכן מופרדים על בסיס המשקל המולקולרי שלהם בג'ל ההפרדה (resolving gel).

בעוד החלבונים נשטפים מהג'ל, הם נלכדים ומרוכזים בפאזה נוזלית. בתא האיסוף ללא הג'ל. לאחר מכן המכשיר עוצר.

בהתבסס על מרווחי זמן שנבחרו מראש, נאספים הפרקציות באמצעות פיפטה. לאחר מכן, מופעל שוב הפוטנציאל כדי ללכוד את פרקציית המשקל המולקולרי השנייה הרצויה. תהליך זה חוזר על עצמו עד שכל הפרקציות המבוקשות נאספות.

כל מחסנית מכילה שמונה ערוצי אלקטרופורזה עצמאיים, כך שהמשתמש יכול להפעיל מספר הערוצים הדרוש לו ולשמור את הערוצים שאינם בשימוש לשימוש במועד מאוחר יותר. כדי להוציא את הפראקציות, פתח את מכסה המכשיר, ולאחר מכן השתמש בפיפט הערוץ המובנה. העבר את ה-150 µL נוזל מכל אחת מתאי האיסוף למבחנות איסוף או לפלטה רב-בארים.

לאחר הוצאת הפראקציות, שטפו את תא האיסוף פעמיים עם בופר הרצה נטול ג'ל על ידי הוספת 100 µL לכל תעלה וביצוע שאיבה ודחיפה (pipetting) פעמיים. לאחר השטיפה, הוסיפו 100 µL של בופר הרצה נטול ג'ל בחזרה לתאי האיסוף. סגרו את המכסה ולחצו על כפתור ההמשך (resume).

מערכת ה-gel free 8, 100 תפעל עד למרווח הזמן הבא. הזמן הכולל שנותר בניסוי מוצג בצד ימין של המסך. לחץ על הכפתור שמעל התיבה המציגה את הזמן כדי לעבור בין זמן שנותר, זמן שחלף ואפשרות להשהיה.

לאחר איסוף כל השברים, ניתן להשתמש בהם באופן מיידי להכנות המשך, כגון מיקוד איזואלקטרי או אלקטרופורזה של ג'ל, או לניתוח באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית, ספקטרומטריית מסות או אימונו-אפיניות. בהדגמה זו, שמונה דגימות חלבון של 200 micrograms כל אחת חולקו ל-12 שברים כל אחת, ובסך הכל ל-96 שברים. כדי להדמיז את תוצאות השבירה, נלקחה מנה מכל אחד מ-12 השברים של דגימת ההומוגנאט של כבד בקר, והורצה על ג'ל 1D סטנדרטי עם צביעת כסף.

כפי שמוצג באיור זה, דגימת החלבון פולטה ל-12 פרקציות נפרדות המקיפות את טווח המשקלים המולקולריים מ-3.5 kilodaltons עד 150 kilodaltons. הג'ל המוצג כאן מדגיש את יכולתו של מערכת gel free 8, 100 לבצע פרקציונציה של כמות גדולה של חלבון לפרקציות בעלות משקל מולקולרי מובחן. זהו כלי רב עוצמה עבור פרוטאומיקה בגישות top-down ו-bottom-up באמצעות ספקטרומטריית מסות, כמו גם עבור ניסויי אימונו-אפיניטי שבהם נדרשת פרקציה בודדת ומסוכנת של חלבון שלם בעל משקל מולקולרי ספציפי.

היה לנו העונג להדגים לכם עד כמה קל להשתמש במערכת הפרדת השברים gel free 8, 100 כדי לחלק את הדגימה שלכם באופן הדידקטי לשברים בעלי משקלים מולקולריים נפרדים, ולהשיג התאוששות גבוהה של השלב הנוזלי. זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.