הידרופובי אוטומטי אינטראקציה כרומטוגרפיה טור בחירה עבור שימוש ב טיהור חלבון

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לבחור עמודת כרומטוגרפיה נוזלית אופטימלית של HI באמצעות שיטת סקירה (scouting) אוטומטית לטיהור של חלבון רקומביננטי, תוך שימוש במערכת כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ בינוני BioRad DUO flow. מטרה זו מושגת תחילה על ידי הכנת התמיסות (buffers) הנדרשות וליזטים בקטריאליים המכילים את החלבון הרקומביננטי המבוקש. לאחר מכן, מערכת הכרומטוגרפיה duo flow מותקנת פיזית, מחוברת לצנרת ומוכנה לפרוטוקול הסקירה.

לאחר מכן טוענים את הדגימות ומפעילים את שיטת סקר עמודי ה-HI המתוכנתת כדי לאסוף את דגימות הפרקציונציה (EIT). לבסוף, מנתחים את ה-EIT ומזהים את עמוד ה-HI והמדיה האופטימליים על בסיס מאפייני ההפרדה שנצפו. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות את מדיה עמוד ה-HI המועדפת לטיהור בקנה מידה מוגדל של החלבון הנחקר באמצעות כרומטוגרפיית נוזלים בלחץ בינוני, תוך שימוש ביכולות סקר עמודי ה-HI האוטומטיות של ה-DUO flow.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון הרצות רצופות של כרומטוגרפיית עמודה ידנית, הוא שהאוטומציה של התהליך מפחיתה את השונות ומבטיחה תוצאות בעלות הדירות גבוהה. בדרך כלל, אנשים שאינם מיומנים בשיטה זו עשויים להתקשות בשל המורכבות הפיזית של מערכות כרומטוגרפיה נוזלית מודרניות. עם זאת, ניתן להגיע לשליטה במערכות אלו בקלות.

לאחר תרגול מספיק, את הפרוצדורה ידגימו אורנג' סטון ושלי אנדרסון, שני סטודנטים מהמעבדה שלי. ראשית, הכינו 500 milliliters של התמיסות הבאות: Sodium phosphate בריכוז 200 millimolar עבור buffer A1, Sodium hydrogen phosphate בריכוז 200 millimolar עבור buffer A2, ו-Ammonium sulfate בריכוז 4.8 molar עבור buffer B2. מים דה-יוניזציה ישמשו כ-buffer B1. יש לבצע ניקוי גזים (degas) מהבאפרים כדי להבטיח תנאי הפעלה כרומטוגרפיים אופטימליים. מערכת ה-maximizer תערבב את buffers A1 ו-A2 כדי ליצור באפר אלוציה פוספטי עם ריכוז מלח נמוך, ותערבב את buffers B1 ו-B2 כדי ליצור באפר Ammonium sulfate עם ריכוז מלח גבוה.

בופר התחלה. הכינו 20 מיליליטר של דגימה להעמסה על ידי ערבוב של 10 מיליליטר של ליזט תאים המכיל את החלבון לניקוי עם 10 מיליליטר של בופר B two. ריכוז האמוניום סולפט הסופי של תמיסת דגימת ליזט התאים צריך להיות בערך 2.4 molar, מה שהופך אותה לשקולה בקירוב לבופר ההתחלה.

סננו את תערובת באפר הליזאט באמצעות מסנן מזרק של 0.45 מיקרומטר בעל קישור חלבוני נמוך כדי להסיר חלקיקים מהתמיסה. השאירו את הדגימה על קרח עד לרגע טעינתה למערכת. ההקמה הפיזית והצנרת של מערכת הכרומטוגרפיה הן מההיבטים המורכבים ביותר של פרוצדורה זו.

הקימו את מערכת כרומטוגרפיית הזרימה הכפולה (duo flow) בהתאם לתרשים המוצג כאן. ודאו כי קיימים נפחים מספיקים של בופר לכל הפרוטוקול וכי הצינורות יישארו טבולים. חברו את שסתום טעינת הדגימות ואת לולאת הדגימה הדינמית כפי שמתואר כאן, וחברו את לולאת הדגימה לכניסת שסתום הדגימות בעמדה שלוש.

הכינו שמונה זוגות זהים של צינורות פיק בקוטר חיצוני של 1/16 אינץ'. לאחר מכן, חברו את הזוגות למיקומים אחת עד שמונה של שני שסתומי בחירת העמודות. לאחר הדלקת נורות גלאי ה-UV ואישור שכל הגלאים מכויילים, חברו את שסתום מפצל הזרימה של אספן הפראקציות ואת בקר המפצל כפי שמוצג כאן.

שסתום הפיצול של אספן השברים בעמדה שתיים ובקר הפיצול מופעלים באופן נפרד מתחנת העבודה הכרומטוגרפית. הגדירו את אחוז הפיצול ל-10. החליפו את ראש הנפילה הסטנדרטי של אספן השברים בעמדה שתיים בראש נפילה לפלטות מיקרו (microplate).

שטפו את לולאת הדגימה והנחילו נוזל במערכת הכרומטוגרפיה. לאחר מכן, התחילו זרימה ידנית של באפר פיתוח (evolution buffer) במערכת בקצב של 1 mL/min. חברו עמודי מלכודת HI של 1 mL לעמדות 2 עד 8 של שסתומי בחירת העמודים.

הסר את המחבר (union) המקשר בין שסתומי בחירת העמודה בעמדה שתיים. חבר את מחברי העמודה במעלה הזרם (upstream) ל-duo flow. העבר את בופר השטיפה (elucian buffer) דרך המחברים עד שכל האוויר יסולק ותיווצר טיפה גדולה של בופר.

בשלב הבא, הסר את הפקק המחובר לכניסת העמודה והנח טיפה גדולה של בופר עם ריכוז מלח נמוך בחלק העליון של העמודה. לאחר מכן, חבר את העמודה למחברי הזרמה (fittings) של מעלה הזרם. חבר את היציאה למחברי העמודה של מטה הזרם ולצינורית שסתום הבחירה.

הגדירו את הגבלת לחץ הגב (back pressure) ל-40 PS.I. שטפו את העמודה בחמישה נפחי עמודה של באפר אלוציה (Evolution buffer) בקצב זרימה של 1 ml/min. שטפו את העמודה ב-10 נפחי עמודה של באפר התחלה (start buffer) בקצב זרימה של 1 ml/min.

לאחר שקווי המתח של ה-pH וה-UV והלחץ האחורי התייצבו, העבר ידנית את שסתומי בחירת העמודה למצב 1 והפסק את זרימת התמיסה המאזנת (buffer). כדי להטעין דגימה, טבול את צינור כניסת הדגימה לתוך דגימת ה-20 milliliter. לאחר מכן, העבר את שסתום שטיפת טעינת לולאת הדגימה למצב 1 ואת שסתום טעינת הדגימה למצב purget.

הפעילו את משאבת טעינת לולאת הדגימה, כך שתישאב הדגימה לתוך צינור המשאבה בקצב זרימה של 1 mL לדקה, עד לרגע הגעת הדגימה לשסתום טעינת הדגימה. העבירו את שסתום טעינת הדגימה ממצב שטיפה (purge) למצב טעינה (load). הפעילו מחדש את משאבת טעינת לולאת הדגימה בקצב זרימה של 1 mL לדקה, עד שיישאבו 10 mL של דגימה לתוך לולאת הדגימה הדינמית, דרך חלון ההגדרות (setup window) בתוכנת ה-biologic.

בחר את מכשיר המערכת המסומנים בכוכבית בטבלה זו. לאחר מכן, בחר שש עמודות HIC לצורך תוכנית בדיקה. גרדיאנט מלח ליניארי יורד ושיטת סקירה (scouting) של שש עמודות יתחילו ידנית את זרימת תמיסת ההתחלה בקצב של 1 mL/min.

לחצו על start בבקר המפצל כדי להתחיל את פיצול הזרם של 90% ל-10% EIT. מיד לאחר תחילת הרצת שיטת התוכנית, לחצו על start בלוח הבקרה שעל המסך של אספן הפרקציות במבנה של לוחית 96 בארות המחוברת באופן offline. עקבו אחר התצוגה בזמן אמת כדי לאשר את פרמטרי ההרצה הצפויים. השוו את עקומת הבליעה של GFP באורך גל של 397 nanometer לעקומת הבליעה הכללית של חלבונים ב-280 nanometer כדי להעריך את ההפרדה והטיהור היחסיים תוך שימוש במדיות HI השונות שנבדקות. ניתן להעביר אליקוטות של 5 עד 50 µL מפרקציות לוחית 96 הבארות ללוחית חדשה ולבצע בדיקה של תכולת חלבון ספציפית באמצעות ELISA או Western blot, ובדיקה של תכולת חלבון כללית באמצעות SDS page או מערכת אלקטרופורזה מיקרופלואידית של Experian. המוליכות של מדרג המלחים ולחץ העמודה המייצגים של הרצות הבדיקה מוצגים כאן.

השינוי בריכוז המלח, כפי שנמדד על ידי אחוז התמיסות שנשאבו מקווי בופר בעל מליחות גבוהה, הוא אופייני למתודולוגיית HI. ככל שריכוז המלח יורד, חלבונים הקשורים לעמודה נשטפים (elute), דבר הבא לידי ביטוי במוליכות, אשר תואמת לריכוז המלח הנצפה; ריכוז המלח נמדד בקו מיד לאחר גלאי ה-quad tech וה-UV. ההיסט (offset) בין גרדיאנט המלח לבין עקומות המוליכות מעיד על הזמן הדרוש לבופר לנוע מכניסת הבופר, דרך המערכת, ועד למד המוליכות.

במהלך הרצת הדגימה, לחץ המערכת וה-pH נותרים קבועים יחסית. איור זה מציג כרומטוגרמות של הרצות סקר רצופות בעמודת HI עם גילוי מקוון של חלבון כולל. זיהוי NGFP מתבצע על ידי מדידת בליעת אור ב-280 nanometers וב-397 nanometers, בהתאמה.

ניתן להעריך את השפע היחסי של GFP ואת ההפרדה עבור כל הרצה של סקירה. על ידי השוואת שני הקווים באיור זה, מבחנות תרבית עבור פראקציות 10, 12, 14, 16 ו-18 של הרצת הסקירה של fennel FF נצפו תחת תאורה סביבתית או תאורת חדר פלורסצנטית, ומבחנות אור על-סגול נצפו הן ממבט חזיתי והן ממבט מלמעלה כדי לבחון את ספקטרום הפליטה האופייני של GFP; ניתן לזהות GFP בבירור בפראקציה 14. בשני התמונות של ה-UV, הכחול המפוזר בפאנל ה-UV השמאלי הוא אור שנפלט ממנורת ה-UV.

נתונים אלו, שנמדדו לאחר ההרצה, תואמים היטב לזיהוי ה-GFP בזמן אמת על ידי מדידת בליעת האלוואנט ב-397 nanometers, אשר גם היא מזהה את פראקציה 14 ככזו המכילה את השיא המרכזי של ה-GFP שאלואされました. לאחר ביצוע פרוצדורה זו, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון western blotting, ELISA, מיקרוסקופיית כוח אטומי ובדיקות רקומינציה ביוכימיות על מנת לענות על שאלות נוספות הנוגעות לטוהר ולפעילות התפקודית של החלבון המטוהר.

במהלך ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור את הצורך בבקרה ידנית של מערכת הזרימה הכפולה במספר נקודות בשיטה. דוגמאות לכך כוללות מילוי חוזר של באפר, טעינת דגימות, בדיקה לאיתור בועות אוויר והדלקה או כיבוי של נורות הגילוי לפי הצורך. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי אופן השימוש במערכת כרומטוגרפיה נוזלית לביצוע סקירה אוטומטית למציאת עמודי HI ומצעים אופטימליים.

הניתוח המעריך, המוצג בפוסטר ובתוכו, יאפשר לחוקר לבחור עמודה מתאימה לטיהור בהגדלת קנה מידה (scale up) בהמשך, אשר ניתן לשלב גם עם שיטות כרומטוגרפיות אחרות כדי להגדיל את טוהר חלבון המטרה ואת התנובה.