ניתוח ופיתוח של הפנוטיפ מורפולוגי כפונקציה של ריכוז חלבון שמרים הנצה

פרוטוקול זה עושה שימוש בפרומוטור בר-בקרה המאפשר ביטוי חלבון מבוקר. בניסוי זה, אנו משתמשים בפלסמיד two micron בעל מספר העתקים גבוה, המבטא את הדומיין N two מפרומוטור המודחק על ידי methionine. תאי שמר מסוג wild type עוברים טרנספורמציה עם פלסמיד זה.

הפלסמיד והטרנספורמנטים נבחרים על פלטות חסרות uol. לאחר גידול למשך לילה במצע סלקטיבי, התאים מסונכרנים על ידי מעצור גידול המתווך על ידי קורטיזול.

לבסוף, הביטוי משרה על ידי העברת תאים למדיה חסרה במתיונין במהלך ניסוי סדרת הזמנים. ריכוז החלבון מנוטר באמצעות western blotting והתפתחות הפנוטיפ המורפולוגי מנוטרת באמצעות מיקרוסקופיה. שלום, אני קלאודיה מהמחלקה למדעי הביולוגיה, אוניברסיטת פירדו.

אני דה ברי מוג'י מהמעבדה של AL וגם מהמעבדה של AL. היום נראה לכם פרוצדורה לניתוח התפתחות של פנוטיפ מורפולוגי כפונקציה של ריכוז חלבון בתוך הגוף. אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדה שלנו כדי לחקור את ההיבטים המורפולוגיים והמולקולריים של פנוטיפ חלוקת תאים שנצפה בעקבות ביטוי יתר של דומיין N2 של החלבון האדפטורי אנדוציטי absent two.

בואו נתחיל. פרוטוקול זה מתחיל בבניית זן שמרים שיבטא את החלבון המבוקש. במקרה שלנו, ביצענו טרנספורמציה לזן השמרים מסוג wild type W 3 0 3 עם DNA פלסמידי בעל מספר עתיקים גבוה המכיל nth two תחת בקרה של פרומוטור met 25 המודחק על ידי מתיונין; 2 millimolar methionine מדכא את פעילות הפרומוטור met 25.

בעוד שמצע הדל במתיונין מאפשר ביטוי מקסימלי, בחר שש מושבות מתוך צלחת המכילה תאים שעברו טרנספורמציה לאחרונה, והעבר אותן ל-50 milliliters של מצע סלקטיבי עם 0.2 millimolar מתיונין בתוך בקבוקonical flask. דגור למשך לילה בטמפרטורה של 30 degrees Celsius עם ניעור ב-200 RPM. למחרת בבוקר, הערק את צפיפות התאים על ידי מדידת הצפיפות האופטית של התרבית ב-600 nanometers. העבר כמות השקולה ל-20 OD 600 nanometers למילילטר של תאים למבחנה סנטריפוגית סטרילית ואסוף אותם באמצעות סנטריפוגציה.

שחזר את התאים במצע YPD באמצעות ערבוב בורטקס כדי לסנכרן את מחזור התאים לריכוז סופי של 15 micrograms per milliliter מתוך תמיסת מלאי של one milligram per milliliter ב-DMSO. דגור במשך ארבע שעות בטמפרטורה של 30 degrees Celsius עם ניעור ב-200 RPM. לאחר ארבע שעות, בדוק את אחוז התאים שעוצרו בשלב המיטוזה.

לאחר התבוננות תחת המיקרוסקופ וספירה של מספר התאים בעלי ניצנים בגודל שווה, עברו לשלב הבא. רק אם העצירה היא גבוהה מ-90%, קצרו את התאים על ידי צנטריפוגציה ב-2200 RPM למשך חמש דקות. לאחר שלושה שטיפות עם מים קרים מאוד, השעיו את המשקע במצע סלקטיבי חסר methionine בצפיפות תאים של כ-0.5 OD 600 nanometers למילילטר.

העבירו מחצית מנפח התאים למבחנה סטרילית חדשה והוסיפו methionine עד לריכוז סופי של 0.2 millimolar. מדגם זה ישמש כביקורת להשפעות הנובעות מרמות בסיסיות של ביטוי חלבון. החזירו את שתי התרביות למדגרה בטמפרטורה של 30 degree Celsius.

תאי הניסוי נסרקו לבדיקת התפתחות הפנוטיפ בכל שעה במשך שש שעות בכל נקודת זמן. העבירו מילליטר אחד של תרחיף תאים מכל תרבית למבחנה סטרילית למיקרוצנטריפוגה וקצרו את התאים באמצעות סנטריפוגציה, שאבו את העלייה (supernatant) והשביהו מחדש את המשקע ב-70 µL של מצע גידול. לאחר מכן, הוסיפו 30 µL של מתילן כחול מתמיס מלאי בריכוז של 1 mg/mL במים סטריליים.

בשלב הבא, טפטפו כ-6 µL מתסמין זה על גשמיות זכוכית נקייה והניחו מכסה זכוכית (cover slip) מעל הטיפה. לחצו בעדינות על מכסה הזכוכית כדי ליצור שכבה דקה ואחידה של תאים בין משטחי הזכוכית. חלקו את מכסה הזכוכית לתשעה רבעים וצלמו שלוש תמונות בכל רבע.

מספר התאים לכל שדה לא יעלה על 30 תאים כדי לאפשר כימות מדויק. ספרו את מספר התאים המראים את הפנוטיפ הנחקר, שבמקרה זה הם תאי שמרים בנביטה עם ניצנים מוארכים ו/או שרשראות של ניצנים שאינם נפרדים זה מזה. נספור גם את מספר התאים המתים, המזוהים על ידי צבעם הכחול, מאחר ופגם בחלוקת התאים נגרם בעקבות nth.

ביטוי יתר כפול מוביל למות תאים, ובכך מאפשר להדמיות של פגמים ספציפיים בפנוטיפ בכל נקודת זמן. העבירו מנה של 1 ml מהתרבית למבחנה מיקרו-צנטריפוגית סטרילית ואספו את התאים על ידי סריפתם בצנטריפוגה. השביעו את משקע התאים ב-100 µL של תמיסת Calcein white בריכוז של 1 mg/mL במים סטריליים, והדגירו למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר בחשיכה.

צביעה ב-calcior white מאפשרת הדמיה של דופן התא. שטפו את המשקע שלוש פעמים ב-1x PBS. השעיו את המשקע הסופי ב-100 µL של PBS.

בחן את התאים תחת המיקרוסקופ ודגום תמונות בהגדלה של 100 x באמצעות אופטיקת UV להדמיית דופן התא. כדי להדמי את ה-septin המסומן ב-GFP, דגום תמונות באמצעות מסנן FS E. כמת את אחוז התאים עם פגמים בדופן התא ומיקום שגוי של septin באמצעות השיטה שהוצגה קודם לכן, על ידי חלוקת הזזית התכסית לתשעת רבעים ודגימה של שלוש תמונות לכל רבע לצורך הספירה. עבור סרטוני TimeLapse, מיקרוסקופיה של תאי שמרים בודדים דורשת מצעי אגרוס (agros beds) טבולים במצע גידול; כדי להכין מצע אגרוס.

ראשית, נקה זכוכית עם שקע קעור באמצעות 70% alcohol והשאר אותה להתייבש באוויר. הרתח 0.06 גרם של agros בחמישה מיליליטר של מצע סלקטיבי ללא methionine במיקרוגל עד להמסה מלאה ומהירה של ה-agros. העבר באמצעות פטה 200 µL מהמצע המכיל agros אל העלייה.

שקע והנח זכוכית כיסוי נקייה נוספת מעליו, תוך וידוא שלא נלכדו בועות אוויר מתחתיה. כאשר הג'ל יתמצק, הרחק את השקופית העליונה בצורה חלקה מהשקופית עם השקע, תוך שמירה על מקביליות בין המשטחים בכל עת. פעולה זו מבטיחה שפני השכבה של הג'ל יהיו בקו אחד עם פני השקופית עם השקע.

נקה את אזור השקופית המקיף את מצע האגרוס (agros bed) באמצעות טישיו עדין. השקופית מוכנה כעת לשימוש לאחר ארבע שעות. העבר 1 mL של תאים מהתרבית למבחנת מיקרו-צנטריפוגה סטרילית ואסוף אותם באמצעות סנטריפוגציה.

שאבו את העילוי ותלו את התאים ב-100 µL של מצע סלקטיבי טרי נטול methionine. מרחו וזלין על שולי זכוכית הכיסוי. לאחר מכן, הניחו טיפה של תגשית התאים במרכז מצע ה-agros והפיצו אותה באופן אחיד על ידי לחיצה עדינה של זכוכית כיסוי מעליה.

אטמו את קצוות זכוכית הכיסוי וקבעו את מיקומה על ידי מריחת לק על השוליים. לאחר שהלק התייבש, הניחו את השקופית על במה מחוממת של מיקרוסקופ. אנו משתמשים במיקרוסקופ Zeiss Axio 200 M המצויד במצלמה דיגיטלית מונוכרומטית Zeiss Axio camm, MRM כדי לבחור שדה המכיל לא יותר מ-10 תאים במרווחים הולמים, כיוון שהשדה יהפוך לצפוף עם הזמן.

במהלך חלוקת התאים, צלם תמונה של השדה בכל חמש דקות למשך כחמש שעות. כדי להימנע מכיוון מחדש של המיקוד שוב ושוב, נתכנת את תוכנת רכישת התמונות לרכוש באופן אוטומטי מספר תמונות Z-stack בכל נקודת זמן.

התמונה עם הפוקוס הטוב ביותר תיבחר מאוחר יותר להרכבת הסרט. כדי להבטיח חום מספיק עבור התאים, מקור חום חיצוני בנוסף לבמות המחוממות סופק על ידי השארת האור הלבן המועבר של המיקרוסקופ דולק למשך כל משך הדמיון. ניתן לחקור נסיגת פנוטיפ על ידי הרכבת התמונות לסרט באמצעות תוכנת Image J. כאן אנו מציגים תוצאות מייצגות של ביטוי יתר של החלבון המדובר. Nth two.

ראשית, ביטוי החלבון של nth two. במהלך מהלך הזמן של הניסוי, נקבע כי ליזאטים מתאים המבטאים HA nth two נותחו באמצעות western blotting באמצעות נוגדן מונאקלונאלי anti HA; כפי שמוצג ב-immuno blot, תאים שגודלו בנוכחות 0.2 millimolar methionine מראים ביטוי חלבון מינימלי. עם זאת, תאים שגודלו במצע ללא methionine מראים עלייה עקבית בריכוז של S two לאורך מהלך הזמן של הניסוי.

תאים שגודלו לאחר מכן בנוכחות או בהיעדר methionine למשך שש שעות נותחו, מכיוון שריכוז נמוך של nth two אינו מסוגל להשרות פנוטיפ של חלוקת תאים או מוות תאי בלבד. אחוז נמוך של תאים מת, כפי שמעיד צבעם הכחול לאחר צביעה ב-methylene blue. באופן דומה, מספר הגרעינים לכל תא, דופן התא וארגון ה-septin הם נורמליים כפי שצפוי.

בניגוד לכך, ביטוי יתר של M two מוביל לפגם מאסיבי בחלוקת התאים ולמוות תאי, כפי שמוצג על ידי שרשראות ארוכות של ניצנים מוארכים ומחוברים השומרים על צבע כחול כאשר הם נצבעים במתילן כחול. מרבית התאים הפנוטיפיים הם רב-גרעיניים, כפי שמעידה צביעת DPI. צביעת Calcior white מדגימה הצטברויות של אזורי דופן תא לא תקינים.

בנוסף, ה-septin ממוקם באופן שגוי באופן גס ואינו מאורגן. הכמות של הפנוטיפ כפונקציה של הזמן מוצגת בגרף זה, שבו העיגולים הפתוחים מייצגים אפס millimolar methionine והעיגולים הסגורים מייצגים 0.2 millimolar methionine. אנו רואים כאן שככל שריכוז ה-nth two עולה בתאים עם הזמן, עולה גם אחוז התאים המראים את פנוטיפ חלוקת התאים.

תאי ביקורת שגודלו בריכוז של 0.2 Milli methionine מראים כי התפתחות הפנוטיפ היא פונקציה של ריכוז חלבון מוגבר ולא בשל תנאי תרבית התאים. לבסוף, התפתחות הפנוטיפ בעת ביטוי יתר של nth two נלכדת באמצעות מיקרוסקופיית וידאו בשיטת time-lapse.

לאחר ארבע שעות של nth, שני תאי ביטוי-יתר מראים פנוטיפ קל של חלוקת תאים מורפולוגית. ככל שהסרט מתקדם, אנו רואים תקופות חריגות וממושכות של צמיחת ניצן אפיקלי, המובילות לניצנים מוארכים מאוד. אנו רואים גם אירועים של הופעת ניצן חדש לפני שחלוקת התאים הושלמה.

בנוסף, ניתן להבחין בניצות שנובטות ממספר אזורים בתא האם, דבר המוביל למראה של הסתעפות. הרגע הצגנו כיצד לאפיין ולנתח התפתחות של פנוטיפ מורפולוגי כפונקציה של ריכוז חלבון בתאי שמרים. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להשקיע את התאים במהירויות הצנטריפוגה המומלצות, שכן מהירויות גבוהות יותר עלולות לגרום לנזק לתאים.

חשוב גם לזכור להוסיף methylene blue וכלוריד ממש לפני ההדמיה, כיוון שהם רעילים לתאי light east. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.