פיזור מיקרוסקופיה אופטית על בסיס דו מימדי מסננים גאבור

בסרטון זה, נעשה שימוש במיקרוסקופיית פיזור אופטי (optical scatter microscopy) כדי לכמת פרגמנטציה מיטוכונדריאלית במהלך אפופטוזיס. למרות שמיקרוסקופיית פיזור אופטי אינה דורשת בדרך כלל פלואורסצנציה בפרוטוקול זה, תמונות פלואורסצנטיות יילקחו לצורכי תיקוף. לאחר הגדרת מערכת ההדמיה, התאים יסומנו ב-MIT tracker green ויטופלו ב-staurosporine כדי להשרות אפופטוזיס.

נתונים אופטיים נרכשים כדי לזהות שינויים באוריינטציה של אבנים cellular organelles בתוך שעתיים. ניתן למדוד את תחילת הפרגמנטציה המיטוכונדריאלית באמצעות נתוני הפיזור האופטי, המראים ירידה בדרגת האוריינטציה של חלקיקים תת-תאיים. לאחר מכן, הנתונים מותקפים על ידי קורלציה בין נתוני הפיזור האופטי לאזורים הפלואורסצנטיים המכילים מיטוכונדריה.

שלום, אני נאדה בוסתני מהמעבדה לאופטיקה ביולוגית במחלקה להנדסה ביו-רפואית באוניברסיטת רטגרס. אני רוב פאק מהמעבדה לאופטיקה ביולוגית, ואני דין, גם אני מהמעבדה הביולוגית. היום נציג בפניכם פרוצדורה לכימות דינמיקה מורפולוגית תת-תאית באמצעות שיטה שאינה מסתמכת על צבעים פלואורסצנטיים.

אנו משתמשים בטכניקה זו במעבדה שלנו כדי לחקור שינויים דינמיים במבנה התת-תאי במהלך אפופטוזיס או מוות תאי תכנוני. אז בואו נתחיל. התחילו את הפרוצדורה על ידי עיקור ידיים כפופות עם 70% ethanol.

לאחר מכן, הניחו במנדף, כאשר האור כבוי וכל המשטחים סטריליים, תמיססת מלאי מוכנה בריכוז 100 nano molar של miot tracker green ומצע גידול של תאי BAEC שחומם מראש. בשלב הבא, הניחו תחת המנדף צלחת תרבית בעלת שישה בארות עם תאים שנשתלו על זכוכית כיסוי. השתמשו בפיפט פסטור המחובר לקו ואקום.

הסיר את מצע התרבית מהבארות. לאחר מכן, הוסף מיד שני מיליליטרים של המצע המסומן לכל בארה כדי לסמן את המיטוכונדריה בתאים. כסה את פלטת תרבית הרקמה כדי למנוע חשיפה לאור חדר ישיר והחזר במהירות את התאים לאינקובטור.

דגרו במשך 45 דקות בטמפרטורה של 37 °C בזמן שהתאים מדגריים. הכינו תחילה את מערך האופטיקה והדליקו את תפסן קשת הכספית. לאחר מכן, הדליקו את המחשב, את מצלמות המיקרוסקופ ואת הלייזר, וחברו את התקן המראות המיקרוסקופיות הדיגיטליות (DMD) למפזר המסתובב.

בשלב הבא, הביטו דרך העינית של המיקרוסקופ כדי לבדוק אם ההזרקה האופטית מיושרת. שדה הראייה צריך להיות מואר בבהירות על ידי אור הלייזר. כדי להטעין את הדגימה, הניחו טיפה אחת עד שתיים של שמן אימרסיה על עדשת אובייקטיב 63x oil immersion כאשר היא נמצאת במצב הנמוך ביותר.

לאחר מכן, הניחו על הבמה זכוכית עם סריג קווים במרווחים קבועים של 10 micrometer הנקראת gradi, והגביהו את העדשה עד שהשמן יתפוס את המיקוד. לאחר מכן, מקדו את הקצה המשושה של שדה הקונדנסור. עצרו כאשר הוא מיושר לתאורת קולר (Kohler) מרכזית.

יש למרכז את השפה המשושה בעין המיקרוסקופ ולהביא אותה למיקוד חד. לאחר מכן, באמצעות כפתורי הכיוון של מעצר השדה של הקונדנסור, יש למרכז את שדה המעצר של הקונדנסור מעל שדה הראייה. הפעל את תוכנת IP lab והזן את ההגדרות להפעלת המצלמה.

וודאו שהמצלמה מוגדרת למצב העברת מסגרות (frame transfer mode). הפעילו את פקודת רכישת המיקוד (acquire focus) כדי להתחיל בתצוגה מקדימה חיה. לאחר מכן, הגדירו את קידומת האינדקס ואת מיקום השמירה עבור התמונות.

בשלב הבא, התחילו בצילום RS. הגדירו את ההגדרות להפעלת מצלמת ה-cool snap. יש להגדיר את מצב השעון (clocking mode) למצב normal.

הפעילו את תוכנת ה-DMD. הגדירו את ה-dark field iris בתפריט הסקריפטים. לאחר מכן, לחצו על load ו-reset.

כדי להריץ את הסקריפט באופן ידני, הגדירו את סרגל האופטיקה (optiv bar) של המיקרוסקופ בתצוגה ל-LSM. פעולה זו תעביר את התמונה דרך ה-DMD באופטיקה המיושרת, ותקרין את תמונת השדה האפוף על ה-CCD של מצלמת Cascade five 12.

תמונת השדה האפל אמורה להופיע בתצוגה המקדימה החיה ב-IP lab. במידת הצורך, התמקדו בתמונה בתצוגה המקדימה החיה. הגדירו את זמן החשיפה למספיק גבוה כדי להבטיח לפחות 10, 000 counts של אות בתמונה.

לאחר מכן, צלמו תמונה של שדה הראייה באמצעות פקודת acquire single לאחר הרכישה. השתמשו בפקודת save as indexed כדי לשמור את התמונה בדיסק. התמונה של ה-GTI מודדת את גודל שדה הראייה.

כעת העבירו את דגימת ה-GTI כך שתהיה מחוץ לשדה הראייה ורק הרקע יהיה גלוי. צלמו תמונת רקע של השדה עם זמן חשיפה המספיק לרכישת לפחות 5,000 counts. תמונה זו תסייע בהפחתת הרקע מהתמונות ללא הסינון.

כעת, כדי לרכוש תמונות מסוננות בגבור (Gabor) של הרקע, טענו את סקריפט בנק מסנני גבור (Gabor Filter Bank) לתוכנת הבקרה של ה-DMD. הרכיצו את הסקריפט במלואו כדי להעביר את המסננים למאזכר המובנה של ה-DMD. פעולה זו עשויה להיארך מספר דקות לאחר שהסקריפט כולו נטען למסנן.

השתמשו בסימני ההתחלה והסיום בתוכנת ה-DMD כדי להבטיח שרק סט אחד של מסננים המתאים למסנן Gabor Like אחד נטען בכל פעם. הפעילו את הסקריפט כדי לרכוש תמויות מסוננות של הרקע. תצוגה המקדימה של התמונה החיה אמורה להשתנות משדה חשוך לתמונה המסוננת.

עבור מסנן זה, פתחו את סקריפט הרכישה ב-IP lab מהדיסק. התאימו את זמן החשיפה כדי להבטיח שיירכשו לפחות 2000 counts. בזמן שסקריפט ה-DMD פועל, בטלו את התצוגה המקדימה החיה ב-IP lab והריצו את סקריפט הרכישה.

פעולה זו תרכוש באופן אוטומטי את האינדקס ותשמור את התמונה המסוננת בדיסק. ברגע שהתמונה הראשונה נרכשת, הפסק את הרצת הסקריפט ב-DMD. מחק את הפקודות שנעשה בהן שימוש מהסקריפט.

לאחר מכן, החליפו את סימני ההתחלה והסיום בתחילתו ובסופו של סט המסננים הבא. חזרו על תהליך הרכישה במעבדת IP עד שכל בנק המסננים ינוצל וכל התמונות המסוננות ירכשו ויישמרו. הכינו את התאים לזריעה על ידי חיבור מלחם לשולחן המעבדה וחימום של מצע L 15 ל-37 °C.

הכינו תחנת עבודה עם נייר סופג ומטפסי Kim wipe כדי לספוג מכל מדיום שנשפך ולשמור על ניקיון האזור. הכינו מספר פתילים על ידי קריעה וגלגול של מטפסי Kim wipe. הפתילים ישמשו למשיכת הנוזל דרך לוח התאים.

בשלב הבא, השתמשו במחזיק הדגימות המתכתי כדי ליצור "סנדוויץ'" של תא. השתמשו במזרק כדי למרוח פס דק של גריז ואקום מסביב להיקף העליון של החור בלוח המתכת המעובד, עד למחצית הדרך מקצות החריצים בכל צד. העבירו בעדינות זכוכית כיסוי נק. 1 נקייה על הגריז.

הפכו את הפיתה למטה ומרחו את הגריז מסביב לחור. כבו את אורות החדר כאשר אתם לובשים כפפות בחינה של NI שעברו סטריליזציה באתנול. הוציאו את התאים מהאינקובטור.

הסיר מהפלטה בעלת ששת הבארים (six Well plate) את לבידת הכיסוי שתשמש לניסוי. ייבש את לבידת הכיסוי בזהירות. לאחר מכן, לחץ את לבידת הכיסוי כאשר צד התא פונה כלפי מטה לתוך הפלטה המתכתית המשומנת, מעל חור התצפית.

הצמדת התאים בתוך הפלטה. ודאו שלא נותרו בועות אוויר, ושהגריז יצר אטם אטום למים כך שניתן יהיה להטעין את המצע. כעת הפכו את הפלטה חזרה והעבירו 200 µL בכל פעם באמצעות פיפטה.

הוסיפו מצע L 15 שחומם מראש אל ה"סנדוויץ'" דרך החריץ שבין כיסוי הזכוכית העליון ללוחית המתכת, עד שהנוזל כמעט מגיע לחריץ בצד השני. לאחר מכן, שטפו את התאים על ידי החזקת פתיל בחריץ הנגדי והזרקה באמצעות פיפטה של 200 microliters נוספים של מצע אל ה"סנדוויץ'". המצע יזרום מצד אחד לשני בעוד הפתיל מסיר את המצע הישן.

הקפידו למנוע היווצרות בועות בתוך הנוזל במהלך שלב זה. חזרו על תהליך זה פעמיים עד שלוש פעמים, תוך שימוש בפיטל חדש עבור כל שטיפה. כעת הפכו את הפלטה פעם נוספת, כאשר אתם תומכים בדפנות הפלטה כדי ללכוד את הנוזל במאגר התא.

טבול את מלחם הבדיל בכלי עם ה-veap כדי להמיס במהירות חלק מה-veap, אשר יידבק לאחר מכן לקצה המלחם. בעזרת קצה המלחם, מרח בזהירות את ה-veap המומס מסביב לקצוות של זכוכית הכיסוי התחתונה. המשך בטבילה ובמריחה לאורך כל היקף זכוכית הכיסוי, עד לאטימה מלאה של זו אל הפחית המתכתית.

פעולה זו יוצרת איטום מכני טוב, כך שזכוכית המכסה לא תיפרד מהלוח בזמן התצפית. נקו כל שאריות מהחלק התחתון של פני השטח של זכוכית המכסה על ידי קיפול של נייר Kimwipe לכדור וניקוי המכסה.

החליקו בתנועה אחת רציפה כדי להבטיח שכיסוי הזכוכית יהיה נקי ביותר במרכז, שם תתבצע הצפייה. החזירו את פלטת ששת הבארות לאינקובטור. העבירו את התאים שבפלטה למעבדה האופטית והניחו אותם על העדשה.

כפי שנעשה קודם לכן, מצאו שדה של תאים שנראים בריאים והשיגו תמונת שדה כהה (dark field) של שדה הראייה. לאחר מכן, כוונו את המיקרוסקופ למצב DIC וּודאו שזמני החשיפה הולמים. השגיח תמונת DIC באמצעות מצלמת cascade.

במערך זה, תמונות פלואורסצנטיות נרכשות באמצעות מצלמת ה-cool SNAP בעוד שהמיקרוסקופ עדיין מכוון ל-DIC. הגדירו את ה-VAR של המיקרוסקופ למכפלה של אחת (one x), את ה-viewport ל-100% binocular, והפנו את התמונה מהעינית אל המצלמה. הניחו נורת LED כחולה מעל הקונדנסור כדי להאיר את השטח.

לאחר מכן, בצעו תצוגה מקדימה של שדה הראייה בתמונת RSS וכווננו את המיקוד העדין. במידת הצורך, רכשו תמונת DIC ושמרו אותה בדיסק. שימו לב כי שדה הראייה שונה מזה שהתקבל ממצלמת הקסקדה (cascade camera).

יהיה צורך לבצע רישום (registration) של תמונות אלו במהלך שלב הניתוח של הניסוי. לאחר מכן, העבירו את קוביית המסננים הפלואורסצנטיים למיקומה ורכשו תמונת פלואורסצנציה על ידי הפעלה קצרה של עירור הפלואורסצנציה באמצעות תריס המיקרוסקופ, וכבו אותו מיד עם השלמת הרכישה. כדי למזער פוטו-בליץ'ינג (photobleaching), שמרו את תמונת הפלואורסצנציה לדיסק.

כדי לרכוש תמונות מסוננות, הגדירו מחדש את המיקרוסקופ לשדה והעבירו את האור דרך יציאת ה-LSM. כפי שנעשה קודם לכן, הריצו את כל הסקריפט של בנק מסנני גabor כדי להשלים את רכישת הנתונים עבור נקודת זמן אחת, בעוד התאים עדיין נמצאים על הבמה ובלי להפריע לשדה הראייה. השתמשו בשיטת הספיגה (wicking method) כדי להחליף את מצע ה-L 15 הרגיל במצע זהה המכיל תמיסת STS בריכוז one micromolar.

במהלך הניסוי, הוסיפו מצע נוסף כדי למנוע התייבשות על ידי הזרקת מצע באמצעות פיפט לתוך החריץ של פלטת התאים, מבלי להסירה מהבמה או להפריע לשדה הראייה. כעת, חזרו על שלבים אלה עבור נקודות זמן עוקבות עד לסיום הניסוי. הנתונים שנאספו יכללו מספר רב של תמונות מסוננות שיש לעבד כדי להפיק את הנתונים המבניים התת-תאיים.

כאן מוצגים שני ניסויים לדוגמה. איור זה מציג תמונות רצופות של דגימת אצות דיאטומאומיות ימיות. המאפיינים המכוונים נראים בבירור.

בדימוי בשדה אפל. התמונות שעברו סינון אופטי המסומנות ב-five equals 0 degrees עד five equal 160 degrees מוצגות לצד התמונה ללא הסינון של הדגימה. להשוואה, קבוצה של תשע תמונות של הדיאטום שעברו סינון גאבור (Gabor filtered) עובדו פיקסל אחר פיקסל לצורך קביעת אוריינטציית האובייקט.

בכל פיקסל, האות המקסימלי חולק באות הממוצע כפונקציה של כיוון המסנן כדי לקבל ערך של יחס גובה-רוחב (aspect ratio). כאן, יחס גובה-רוחב הקרוב לאחד, המסומן בכחול, מופיע באזורים שבהם אין זווית תגובה מועדפת. ערכים גבוהים יותר, המסומנים באדום, מצביעים על אזורים שבהם קיימת תגובה חזקה יותר לזווית מועדפת.

הבהירות והמשמעות של קוד תגובת מסנני GABOR הכוללת, והכיוון של המסנן המעניק את האות המקסימלי בכל פיקסל, תואמים לכיוון המאונך לכיוון האובייקט הבסיסי. כיוון חלקיקי תת-המבנה מקודד בתרשים חיצים (quiver plot), שבו כל קו תואם באופן הדוק לכיוון האובייקט המקומי הנראה בתמונה בשדה חשוך ללא סינון. תרשים החיצים מציג את כיוון האובייקטים עם עצימויות תגובה הגבוהות מ-10% מהמקסימום.

תמונות שדה אפל ומסננות אופטיות אלו של שטח המכיל תאי אנדותל בקרים של בקר, כאשר תמונות מסוננות נרכשו לאחר מכן כל 20 דקות למשך שלוש שעות לאחר טיפול במשרה האפו פטוזיס staurosporine. כאן, מפת יחס הגובה-רוחב בפאנל העליון והדימות הפלואורסצנטי של מיטוכונדריה בפאנל התחתון מוצגים כפונקציה של הזמן. גוון הצבע מייצג את דרגת האוריינטציה; בדומה לכך, גרפי זמן אלו משווים את הירידה בדרגת האוריינטציה של יחס הגובה-רוחב של החלקיקים בתאי אנדותל שטופלו ב-staurosporine, כאשר העקבות הבודדים מייצגים גרפי זמן בתוך תאים בודדים.

הכוון של הטיפה מוגבל לאזורים בתאים התואמים לאזורים הפלורסצנטיים. כעת, הושלמה האימות מול הפלורסצנציה. הדבר הופך למסמך ארכיוני.

לפיכך, בניסויים הבאים, ניתן לבצע את המדידות המיטוכונדריאליות על ידי השמטת שלבי דימוי הפלואורסצנציה ושימוש ישיר בשיטת הפיזור האופטי. הרגע הדגמנו כיצד לנטר פרגמנטציה מיטוכונדריאלית במהלך אפופטוזיס באמצעות חתימות פיזור אור המבוססות על מסנני Gabor. בעת ביצוע הליך זה, חשוב להקפיד על הכנה נאותה של הדגימות ולוודא שהמערך האופטי מיושר ומכויל היטב.

אם כן, בואו נתחיל לצפות ולשתף פעולה עם ניסויי UI ב-CoLab.