מיקרוסקופיה קונפוקלית מגלה התא קולטן משטח צבירת דרך התמונה המתאם ספקטרוסקופיה

המטרה הכוללת של פרוטוקול ספקטרוסקופיה זה של מתאם תמונה היא לספק מתודולוגיה נגישה לכימות אירועי אשכולות המתרחשים על פני התא. נוגדנים הנקשרים לקולטנים על פני התא יכולים להעניק אישור ושינויים באשכולות. ניתוחים של תהליכים דינמיים אלה חשובים לאפיון מטרות התרופות.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת מתודולוגיה נגישה לכימות אירועי אשכולות על פני התא באמצעות מכשירי הדמיה נגישים בקלות. כדי להתחיל, זרע 10,000 תאי קרצינומה אפידרמואידים A431 לכל באר של שקופית הדמיה בת שמונה חדרים. למחרת, הוסף 100 ננוגרם למיליליטר של ליגנד EGF באופן מיידי לתאים על מנת לעורר צבירת קולטני EGF.

דגרו את התאים עם הליגנד בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות לפני קיבועם. לאחר מכן, עקוב אחר פרוטוקול האימונוציטוכימיה וההדמיה הקונפוקלית בפרוטוקול הטקסט הנלווה, תוך שימת לב רבה להגדרות המשמשות במהלך האיסוף, וטען את מערכי הנתונים שנרכשו לפיג'י. יש להימנע מרוויית יתר.

התמונות הסופיות חייבות לכלול גדלי פיקסלים של פחות מ-1 מיקרון בריבוע. בנוסף, לכוד משטח שטוח על המשטח האפיקלי או הבסיסי וכן אזור נטול תאים לנורמליזציה מאוחרת יותר של הדגימה. התחל בזיהוי אזור המעניין של קרום פני התא האפיקלי או הבסיסי בתמונה הראשונה.

בחר גודל פיקסל של 2 עד n בטווח של 256 על 256, 128 על 128 או 64 על 64. לאחר מכן, עבור לתפריט התמונה ובחר שכפל. לאחר מכן, עבור לניתוח, וירד למדידות.

חשב את העוצמה הממוצעת של אזור העניין שנחתך. כעת, זהה אזור רקע באותו גודל מהתמונה המקורית. שכפל אותו כמו קודם.

ולחשב את העוצמה הממוצעת של אזור העניין שנחתך ברקע. לאחר מדידת אזור העניין והרקע, עבור אל תהליך ובחר מחשבון תמונה. מקם את אזור העניין כתמונה 1 ואת תמונת הרקע כתמונה 2, ובחר החסר כפעולה.

לאחר מכן, עבור לתפריט התהליך. רדו אל FFT ובחרו FD Math. בתיבת הדו-שיח מתמטיקה FFT, בחר הזן את התמונות כפי שמוצג כאן והגדר את הפעולה למתאם.

ודא שהטרנספורמציה ההפוכה מופעלת. נרמל את התמונה המתקבלת על ידי בחירת תהליך, גלילה מטה למתמטיקה, בחירה באפשרות חלוקה והזנת המספר הכולל של פיקסלים בתיבת הדו-שיח. לאחר מכן, נרמל שוב על ידי חלוקה בעוצמה הממוצעת של השטח החתוך המנורמל בריבוע.

לאחר מכן, צייר קו באמצעות פונקציית התפשטות הנקודה. שרטט את הפרופיל של קו זה כדי לחשב את ערך השיא על ידי מעבר לניתוח ובחירת פרופיל עלילה. חשב את האשכולות לכל שטח אלומה על ידי העברת ערך השיא לגיליון אלקטרוני.

לאחר מכן הגדר את האשכולות לכל שטח אלומה שווה לאחד מעל ערך השיא מינוס אחד. על מנת לעבד את התמונות באצווה, מומלץ ליצור מאקרו פיג'י. זה מאפשר ניתוח עקבי ומהיר של תמונות קונפוקליות מרובות לניתוח ספקטרוסקופיה של מתאם תמונה.

כדי ליצור מאקרו עבור זרימת העבודה של ספקטרוסקופיה של מתאם תמונה, הגדר את התוכנית להקליט כל פקודת תפריט בפרוטוקול. לשם כך, עבור אל יישומי plug-in, למטה אל marcos, ובחר הקלט. לאחר מכן, חזור לחלון הראשי ועבור על הפרוטוקול המתואר בסעיף הקודם של סרטון וידאו זה.

בסיום, חזור לחלון המאקרו ובחר צור כדי ליצור מאקרו. לאחר מכן, בחלון עריכת המאקרו, הקפד לבחור את השפה כמאקרו LJ1. אם לא נבחר, התוכנית לא תוכל לפעול.

לבסוף, שמור את המאקרו. פונקציית ההעברה האופטית של מיקרוסקופ מבטיחה שאפילו עצמים בגודל מולקולרי יופיעו כתמונות בין 200 ל-300 ננומטר במישור ה-XY. על ידי הדמיית חרוזי פרסין ברזולוציה נמוכה באותו אופן כמו תאים כמתואר בפרוטוקול זה, ניתן לחשב את שטח פונקציית ההתפשטות הנקודתית של המיקרוסקופ.

תמונות אלה מייצגות תאי קרצינומה אפידרמואידים A431 מגורים ובלתי מדומים המסומנים בנוגדנים ראשוניים של צטוקסימאב המכוונים לקולטן EGF על פני התא. הקופסאות הצהובות מייצגות קרום תא המכיל אזורי יבול עם מידות פיקסלים של 64 על 64. תמונות אלו שימשו לביצוע ניתוח ספקטרוסקופיה של מתאם תמונה.

לאחר נורמליזציה של פונקציית המתאם האוטומטי, ניתן למדוד את פונקציית התפשטות הנקודה באמצעות כלי הקו. הפרופיל של פונקציית קו זו משורטט כדי לזהות את ערך השיא. באמצעות שיטות אלה, גירוי ה-EGF נצפה כגורם לירידה של פי 2.56 באשכולות EGFR שזוהו לאזור אלומה בהשוואה לתאים לא מגורים.

לאחר השליטה, ניתוח התמונות הקונפוקליות שלך ייקח רק כמה דקות לכל תמונה. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לאסוף שכפולים מרובים של כל מצב ניסוי באמצעות ההגדרות המתוארות בפרוטוקול זה. בעקבות הליך זה, ניתן להרחיב את ספקטרוסקופיית מתאם התמונה כדי לחקור את השינויים הזמניים של אירועי אשכולות בתאים חיים באמצעות מיקרוסקופ זמן-lapse.

לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים לחקור מצבי צבירה מסדר גבוה יותר באמצעות ICS הלבנת פוטו תוך לוקליזציה משותפת של שני חלבונים מבוססי ממברנה באמצעות מתודולוגיות ספקטרוסקופיה של מתאם צולב תמונה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לחשב את מצב האשכולות של מולקולת פני התא המעניינת שלך.