גרורה ניסויית Assay
24 באוגוסט 2010
מאמר זה מתאר את הנהלים של assay גרורות ניסיוני המשמש כדי לקבוע את פוטנציאל גרורתי של שורות תאים סרטניים אנושיים.
המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לבחון את יכולות הגריעות של תאי סרטן אנושיים באמצעות הזרקה לווריד הזנב. התאים מוחזרים להזרקה בעכברים עם חסר חיסוני. לאחר מכן, התאים מוזרקים לעכברים עם חסר חיסוני, אשר יפתחו גרורות בריאות לאחר חודש עד חודשين.
העכברים מנוסחים, והגרורות בריאות נספרות ומגודלות בתרבית. תוצאות של סוג זה של בדיקה מעידות על היקף הגרורות של סוג מסוים של תאי סרטן. שלום, אני סונאלי מוהאנטי מהמעבדה של ד"ר LE במחלקה לגנטיקה ביו-רפואית באוניברסיטת רוצ'סטר.
היום נדגים לכם פרוצדורה לביצוע בדיקת גרורות ניסויית. אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדה שלנו כדי לחקור גרורות של סרטן. אז בואו נתחיל.
התחילו עם תאים שהגיעו לכ-70% שקיעות (confluency). שאבו את המצע מהצלחת ושטפו בעדינות פעם אחת עם 1X PBS. לאחר מכן, הוסיפו שני מיליליטרים של 0.05% Trypsin. נערו בעדינות את הצלחת כדי להקל על ניתוק התאים.
עקוב אחר התאים תחת מיקרוסקופ בזמן שהם ניתקים. הוסף נפח מספיק של מצע הכולל FBS כדי לעצור את פעילות ה-trypsin. לאחר מכן, העבר את התוכן למבחנה של 50 milliliter.
ספרו את התאים באמצעות המוציטומטר (hemo cytometer). לאחר שנקבע הריכוז, סבבו בצנטריפוגה בכ-200 ×g למשך שלוש דקות, מבלי להפריע למשקע התאים. הסירו בזהירות את המצע וסבבו מחדש בנפח מתאים של תמיסת Hank's balance buffer solution או HBSS כדי להגיע לריכוז סופי של כ-5 × 10⁶ תאים למילליטר.
בשלב הבא, סנננו דרך מסנן תאים של Falcon בעובי 70 מיקרומטר. כדי להסיר מקבצי תאים גדולים, הניחו את קצה הפיפטה ישירות על המסנן, המוצב מעל מבחנת תרבית של חמישה מיליליטר. דחפו במהירות את התוךית דרך המסנן אל תוך המבחנה.
ספרו את התאים שוב באמצעות trypan blue כדי לקבוע את החיוניות. החיוניות צריכה להיות גבוהה מ-90% לפני ההזרקה. לאחר מכן, דללו לריכוז סופי של 2.5 × 10⁶ תאים למילליליטר.
יש לשמור על קרח. תפסו בעדינות את זנבו של עכבר עם חסר חיסון ומשכו אותו אל תוך המגביל לעכברים, כך שגבו יישען על החריץ וזנבו יבלוט מהפתח הקטן שבחלק האחורי. החליקו באיטיות את הטבעת פנימה לאורך החריץ.
ברגע שהטבעת תופסת את פיו של העכבר, נעלו אותה במקומה. העכבר לא צריך להיות מסוגל לנוע בחופשיות, אך קצב הנשימה שלו צריך להישאר רגיל. אתרו את ורידי הזנב הראשיים.
ארבעה כלי דם עיקריים נמצאים בזנב של עכבר. העורקים ממוקמים בצדדים הגבי (dorsal) והבטני (ventral) של הזנב. הוורידים ממוקמים בצדדים הלטרליים.
שאבו לפחות 200 µL מהתאים שהוכנו לתוך מזרק של 1 mL. חברו מחט דקה בכי মাপ 30 ודחפו החוצה בועות אוויר. הנפח הסופי במזרק צריך להיות 200 µL.
הכינו את הדגימה להזרקה אל הקצה הדיסטלי של הזנב. כך, אם הניסיון הראשון ייכשל, ניתן יהיה להשתמש באזור פרוקסימלי יותר של הזנב לניסיון שני. לאחר ניגוב אתר ההזרקה ב-70% ethanol, משכו את הזנב למצב ישר.
החזקו את הטיפ באמצעות האגודל ותמכו בנקודת ההזרקה באמצעות האצבע. הכניסו את המחט לווריד והזריקו את התאים. ודאו שהמחט והמזרק מקבילים לווריד במהלך ההזרקה.
אחרת, המחט תחדור דרך דופן כלי הדם והתאים יוזרקו לרקמות הזנב הסמוכות. הוצא את המחט אם הפרוצדורה הצליחה. דם אמור לזרום מאתר ההזרקה.
הצמד כדור צמר גשים נקי כדי להקל על ניקוי השאריות, ובצע מישוש (palpation) של הזנב כלפי מעלה כדי לדחוף כל דגימה שנותרה אל תוך מחזור הדם. שחרר את העכבר מהמכשיר למניעת תנועה והחזר אותו לכלוב. רשום במחברת המעבדה את מספר ניסיונות ההזרקה ואת מספר התאים שהוזרקו.
קבעו את חיות התאים לאחר ההזרקה. כפי שצוין קודם לכן, שלב זה מספק ביטחון בכך שהתאים נשארים בחיים לאורך תהליך ההזרקה. בסיום ניסוי ההזרקה, חיות התאים תרד, אך היא אמורה להישאר מעל 80%. כשלב אופציונלי, סובבו (spin down) את התאים הנותרים ושטפו את המשקעים ב-PBS פעם אחת.
לאחר מכן, הקפיאו את המשקעים במינוס 80 מעלות צלזיוס (80°C-) לצורך אנליזות עתידיות, כגון western blotting. כדי לאשר ביטוי גנים ב-knockdowns, לאחר חודש עד חודשיים, בצעו נתיחה של העכברים כדי לקבוע את מיקומי הגרטורות. התחילו במיקום העכבר שהורג על תחנת נתיחה.
רססו את העכבר בנדיבות באתנול. חתכו את כלוב הצלעות כדי לחשוף את הריאות והלב. לאחר מכן, הוציאו אותם בזהירות והניחו אותם ב-PBS.
הריאה היא האתר העיקרי לגרורות מאחר שהיא מכילה את מיטת הנימים הראשונה שהתאים פוגשים. לאחר כניסתם למחזור הדם, הסירו את הלב ושטפו את הריאות ב-PBS, ולאחר מכן בחנו כל אונה של הריאה תחת מיקרוסקופ דיסקציה. ספרו את מספר הגרורות הניתנות לזיהוי בשני צדי הריאה, ולאחר מכן סכמו את מספר הגרורות בכל ארבע האונות יחד כדי לקבוע את המספר הכולל של גרורות בריאות.
בשלב הבא, בודדו גרורות ריאה בודדות באמצעות כריתה עם מספריים. העבירו כל גרורה למסננת תאים של 70 מיקרומטר וקטעו אותה באמצעות קצה של מכסה מחט סטרילי. שטפו את מסננת התאים עם מספר מיליליטרים של מצע ואספו את התאים שעברו דרך המסנן.
בתוך צלחת תרבית, כאשר כל צלחת מכילה תאים מגרורה אחת. דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 °C למשך ארבעה ימים לפחות ללא הפרעה. בתחילה, הן תאי הסרטן והן תאי הפיברובלסטים יגדלו על הצלחות, אך בהדרגה תאי הפיברובלסטים ימותו ויוחלפו על ידי תאי הסרטן.
אם תאי הסרטן נושאים גנים העמידים לתרופות, בחר את התאים באמצעות האנטיביוטיקה המתאימה. לאחר שלושה ימים, שטוף בעזרת PBS שאריות דם או רקמה מהצלחת והוסף מצע טרי. העריך את טוהר התאים המופקים באמצעות צביעה אימונולוגית עם נוגדנים לחלבונים ספציפיים לאדם; במקרה זה נעשה שימוש בנוגדן anti-human גם בהיעדר ברירה באמצעות תרופות. יותר מ-99% מהתאים צריכים להיות אנושיים.
ניתן כעת להזריק שוב את התאים שהופקו למשכי עכברים עם חסר חיסוני כדי לבחון את יכולות הגרירה המטסטטית שלהם בסיום בדיקה זו. שורת תאי סרטן בעלת פוטנציאל מטסטטי גבוה תגרום בדרך כלל להיווצרות גרורות רבות בריאות, בעוד ששורת תאי סרטן בעלת פוטנציאל מטסטטי נמוך תגרום להיווצרות גרורות מעטות מאוד בריאות. תמונות אלו מציגות גרורות בריאות חודשיים לאחר הזרקה של שורת תאי מלנומה אנושיים.
A 3 7 5 sm. תאים שהופקו בשיטה זו גורמים בדרך כלל ליותר גרורות מאשר השורה ההורית כאשר הם נבדקים. שוב באמצעות בדיקה זו, הצגנו בפניכם את הפרוצדורה לביצוע בדיקת גרורות ניסויית.
בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב מאוד לזכור לוודא שהתאים מוזרקים לווריד הזנב, אך לא לרקמות הזנב. זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר בדיקת גרורות ניסויית המשמשת להערכת הפוטנציאל המטסטטי של שורות תאי סרטן אנושיים באמצעות הזרקה לווריד הזנב בעכברים עם חסר חיסוני.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- אונקולוגיה
- חקר גרורות
- ביולוגיה ניסויית
רקע
- הבנת גרורות הסרטן היא קריטית לפיתוח טיפולים יעילים.
- בדיקות ניסיוניות מסייעות בכימות הפוטנציאל הגרורתי של תאי סרטן.
- עכברים עם חסר חיסוני מהווים מודל מתאים לחקר התנהגותם של תאי סרטן אנושיים.
- הזרקות לווריד הזנב הן שיטה נפוצה להערכת גרורות בריאות.
מטרת המחקר
- לבחינת היכולות המטסטטיות של תאי סרטן אנושיים.
- לכימות וגידול של גרורות ריאה שנוצרו מתאים שהוזרקו.
- לספק תובנות לגבי הפוטנציאל המטסטטי של שורות תאי סרטן שונות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת תאי סרטן אנושיים להזרקה.
- הזרקת תאים לווריד הזנב של עכברים עם חסר חיסוני.
- מעקב אחר התפתחות גרורות בריאות לאורך חודש עד חודשיים.
- ניתוח עכברים לצורך כימות ובידוד של גרורות ריאה לתרבית.
תוצאות עיקריות
- היווצרות מוצלחת של גרורות בריאות מתאי סרטן שהוזרקו.
- כימות הגרורות מספק נתונים על הפוטנציאל הגרורתי.
- ניתן להשתמש בגרורות שגודלו בתרבית לצורך ניתוחים נוספים.
- התוצאות מצביעות על שונות ביכולות הגרורתיות בין שורות שונות של תאי סרטן.
מסקנות
- בדיקת הגרורות הניסויית יעילה להערכת התנהגותם של תאי סרטן.
- התובנות שנרכשו יכולות לסייע בגיבוש אסטרטגיות טיפוליות נגד סרטן גרורתי.
- מחקרים עתידיים יכולים להתבסס על ממצאים אלו כדי לבחון את המנגנונים שבבסיסם.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית ניהולית
בדיקת גרורות ניסויית מספקת מודל כמותי in vivo להערכת הפוטנציאל הגרורתי של שורות תאי סרטן אנושיים, ובכך תומכת בתיקוף מטרות (target validation) ובהפחתת סיכונים מכניסטיים בתהליך גילוי תרופות לאונקולוגיה. על ידי מתן אפשרות לבידוד והנחלה של נגזרים גרורתיים מאוד, הבדיקה מקלה על זיהוי גנים ומסלולים המווסתים את ההתקדמות הגרורתית, ובכך מספקת מידע לזיהוי מובילים (lead identification) ותיעדוף פרה-קליני. גישה זו מגבירה את הביטחון החזוי בפיתוח תרופתי בהמשך, על ידי קישור ממצאים in vitro לתוצאות גרורתיות תפקודיות במערכת הרלוונטית למחלה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות כימות היכולת המטסטטית של תאי סרטן בעקבות הפרעה גנטית או פרמקולוגית.
- ערך תפעולי: מספק תוצאה הניתנת לשחזור in vivo לצורך תיקוף תפקודי של מטרות במסלולים הרלוונטיים למטסטזה.
- ערך מדעי: תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי קישור שינויים מולקולריים לפנוטיפים מטסטטיים בעכברים עם מערכת חיסונית מוחלשת.
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: מייצר ספירות כמותיות של גרורות המשמשות כמשתנים תלויים לסריקת מודולטורים של התפשטות גרורתית.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של הליכי הכנת התאים, ההזרקה וקצירת הרקמות כדי להבטיח הדירות בין ניסויים.
- ערך מדעי: מאפשר גזירה של שורות תאים גרורתיים בעלות תכונות פלישה מוגברות לשימוש בסריקה משנית ובדה-קונבולוציה של מטרות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: משתמש במערכת רלוונטית למחלה שבה היווצרות גרורות בריאה משקפת דפוסים קליניים של התפשטות המטוגנית.
- ערך תפעולי: תומך במחקרים אורכיים על ידי מתן אפשרות להזרקה חוזרת של גרורות שגודלו בתרבית, כדי להעריך את היציבות של הפנוטיפ הגרורתי.
- ערך מדעי: מקל על גילוי סמנים ביולוגיים על ידי מתן אפשרות לאפיון מולקולרי של גרורות מבודדות בהשוואה לשושלות התאים המקוריות.
שילוב תהליכי עבודה ומסלולי עיבוד
הבדיקה משמשת ככלי בשלב הגילוי המגשר בין בדיקת היפותזת המטרה לבין תיקוף פנוטיפי, ובכך מסייעת בקבלת החלטות לגבי קידום תרכובות ומעקב מכניסטי במסלולי פיתוח בתחום האונקולוגיה.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בחקירה מונחית-השערה של רגולטורים של גרורות באמצעות בדיקות כמותיות של התנחלות בריאות.
- סריקה: מספק תוצאות סטנדרטיות וכמותיות (מספר גרורות לריאה) המאפשרות השוואה בין תנאים גנטיים או כימיים.
- אנליטיקה: מייצר נתונים מבוססי-ספירה המתאימים לניתוח סטטיסטי לקביעת הבדלים משמעותיים בפוטנציאל הגרורתי.
- מחקר תרגומי: מקשר בין שלב הגילוי המוקדם לתיקוף פרה-קליני על ידי אספקת מודל המשקף טרופיזם גרורתי ספציפי לאיבר.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה ניתנת לשימוש חוזר להערכת יכולת גרורתית במגוון סוגי סרטן ובשיטות טיפוליות שונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בבחירת מטרות על ידי הדגמת קשרים סיבתיים בין מודולציה של גנים לבין דיכוי או הגברה של גרורות.
- ערך תפעולי: מבטיח שחזור באמצעות ספי מסיאות תאים סטנדרטיים (>90% לפני ההזרקה, >80% לאחר ההזרקה) ונפחי הזרקה סטנדרטיים.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת החלטות ה-go/no-go על ידי אספקת נתונים פונקציונליים על גרורות המשלימים בדיקות פלישה ושגשוג in vitro.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של מטרות מותאם סיכונים, בהתבסס על השפעתם המוכחת על נטל הגרורות in vivo.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול בבעלי חיים, בטכניקות של הזרקה לווריד ובדיסקציה אספטית של רקמות.
- תלוי בגישה למודלים של עכברים עם חסר חיסוני ובמתקנים לאכסון בעלי חיים לטווח ארוך (חודש עד חודשיים).
- מחייב פרוטוקולים סטנדרטיים להכנת תאים, להערכת חיוניות ולכימות גרורות כדי למזער שונות.
- כולל שיקולים טכניים לבידוד גרורות, כולל דיסוציאציה אנזימטית או מכנית וסינון לקבלת תרביות של תאים בודדים.
- מוגבל למידול של הפצה מוקדמת וקולוניזציה בריאות; אינו לוכד שלבים מאוחרים יותר של גרורות, כגון extravasation או צמיחה באיברים מרוחקים מעבר לריאות.
