גרורה ניסויית חיסוני CTL המאמצת העברת דגם עכבר
26 בנובמבר 2010
גרורות הריאה ניסיוניים מודל CTL עכבר חיסוני לניתוח האינטראקציה תאים סרטניים תא-T In vivo.
המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לבחון את היעילות של אימונותרפיה באמצעות העברה אדופטיבית של תאי T ספציפיים לגידול in vivo. דבר זה מושג תחילה על ידי השתלת תאי גידול באמצעות הזרקה לווריד הזנב הצדי בעכברים, במטרה להקים גרורות בריאות. השלב השני של הפרוצדורה הוא טיפול בעכברים הנושאים את הגידול באמצעות לימפוציטים T ציטוטוקסיים CTLs ספציפיים לגידול.
השלב הסופי הוא שימוש בדיו הודו (India ink) כאמצעי לוויזואליזציה וככימות של קשרי גידול. בסופו של דבר, ניתן להפיק תוצאות המראות את ה-CIE של טיפולים שונים באמצעות מדידת גודל הגידול וכימות מספר קשרי הגידול. שלום, שמי מרי צימרמן ואני חברה במעבדתו של ד"ר קווין לו (Dr. Kevin Lu) במכללה לרפואה של ג'ורג'יה (Medical College of Georgia).
שלום, שמי Shelene Hu. אני סטודנטית בשנה השנייה ואני עובדת גם במעבדה של Dr. Lou. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות מסורתיות, כגון עקומות הישרדות, הוא שההליך הנוכחי הוא איכותני וכמותי כאחד. להשלכות של הטכניקות הללו עשוי להיות השפעה על טיפולים בסרטן, כיוון שהן מדמות אימונותרפיה אדופטיבית של תאי T בחולי סרטן בבני אדם.
נתחיל בתהליך. ביום שלפני הזרקת תאי הגומלה, זרעו בבליל T75 אחד עד 1×10⁷ תאי CMS-4met ב-10 מיליליטר של מצע RPMI המכיל 10% סרום. כדי לקבל תאי גומלה הצומחים במהירות, דגרו אותם למשך הלילה בטמפרטורה של 37°C ביום ההזרקה.
הסיר את המצע ושטוף את התאים פעם אחת עם PBS, לאחר מכן קצור את תאי הגידול באמצעות 0.05%trypsin EDTA בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך חמש דקות. עצור את התגובה עם 10 milliliters של מצע RPMI המכיל 10%serum. העבר את התאים למבחנה קונית.
סובב את התאים במהירות של 1300 RPM בצנטריפוגה מסוג val legend RT למשך שלוש דקות. בטמפרטורת החדר, הסר את העלייה (snat), השהה מחדש את התאים ב-10 milliliters של one XHB Ss טרי לשטיפה. לאחר מכן, סובב שוב והשהה מחדש באותו אופן.
ספרו את תאי הגידול באמצעות hemo.Cytometer. דללו את התאים ב-HBSS כך שניתן יהיה להשעות את כמות התאים הדרושה לכל הזרקה. בנפח כולל של 100 microliters, חממו את עכברי ה-B SEA בני שש עד שמונה שבועות בתוך כלי זכוכית טבול במים חמים.
כדי להרחיב את וריד הזנב, מקמו את העכבר במכשיר קיבוע לווריד הזנב על המדף. השתמשו במזרק מיקרו כדי להזריק 100 µL של תאי גידול לווריד הזנב הלטרלי. השתמשו בטכניקה סטרילית כדי למנוע זיהום לאחר ההזרקה.
הפעילו לחץ קל על אתר ההזרקה עד להפסקת הדימום. החזירו את העכבר לכלוב ואפשרו לגידול לגדול לשלב הרצוי. ביום ההעברה, בצעו פיפטור מעלה ומטה כדי להשעות מחדש לימפוציטים T ציטוטוקסיים מוצמדים (purified cytotoxic T lymphocytes או CTLs) שהוכנו.
כפי שמתואר בטקסט, העבירו את כל התאים מתוך צלחת אחת לשפופרת קונית בנפח 15 מיליליטר, תוך הקפדה שהנפח לא יעלה על שני שלישים מהשפופרת. הכניסו פסטור פפיפט סטרילית לשפופרת הקונית והוסיפו בשכבה מתווך להפרדת לימפוציטים או LSM מתחת לתאים, עד שהנפח הכולל יתקרב ל-14 מיליליטר.
הקפידו לא להפריע לשכבות. סבבו בצנטריפוגה במהירות של 2000 RPM למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. אין להשתמש בבלם כדי להאט את הרוטור לאחר הסבב, העבירו את ה-CTLs לפרוקת קונית חדשה של 15 מיליליטר.
הוסיפו HBSS לנפח של כ-10 מיליליטר. לשטיפה. ספרו את התאים, סובבו במערך צנטריפוגה במהירות של 1300 RPM למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר, וסספנדו מחדש ב-HBSS לצפיפות התאים הנדרשת להזרקות.
שמרו על נפח כולל של 100 microliters לכל הזרקה. השתמשו בטכניקת ההזרקה לזנב כפי שהודגמה קודם לכן בסרטון זה. כדי להזריק את ה-CTLs לעכברים עם גידולים, החזירו את העכבר לכלוב ואפשרו ל-CTLs להקיף את הגידול ולפעול עליו.
עכברים נשחטים בדרך כלל לצורך אנליזה 14 עד 21 ימים לאחר הטיפול ב-CTL. כדי להדמיץ גרורות בריאות, הנח עכבר נשחט על גבו על לוח קלקר. הצמד את הרגליים בעזרת סיכות כדי להבטיח גישה ללא הפרעה לקנה הנשימה.
רססו את הצד הגחוני ב-70% ethanol, החל מאמצע הבטן. השתמשו במספריים כדי לגזור לאורך קו האמצע דרך כלוב הצלעות וכלפי מעלה לכיוון בלוטות הרוק. חשפו את הקנה (trachea).
השתמשו בפינצטה כדי להסיר רקמות הסובבות את הקנה. השחילו קצה של פפפיה של 200 microliter מתחת לקנה תוך כדי החזקת הקצה ביד אחת. הרימו בעדינות את הקנה למעלה והרחיקו אותו מהגוף.
סובב את הפלטפורמה ב-180 מעלות. השתמש במזרק של 50 milliliter כדי להזריק דיו הודים לתוך הריאות דרך הקנה. נפח את הריאות לחלוטין בעזרת הדיו עד שתרגיש התנגדות חזקה.
השתמשו במספריים כדי לחתוך את הקנה. החליקו פינצטה מתחת לריאות והרימו אותן מתוך העכבר. שטפו את הריאות קצרה בביקר של ליטר מים בתוך מנדף כימי.
העבירו את הריאות למכל זכוכית המכיל חמישה מיליליטרים של תמיסת FTI. רקמת הגידול תופיע כקשריות לבנות על הריאות השחורות. לאחר מספר דקות, ניתן לספור את הגידולים ולהשאים בתמיסת FTI ללא הגבלת זמן.
ריאות של עכברים שהוחדרו בתאי קרצינומה של הגומלה. שורת תאים 4T1 מראה נקודות לבנות המעידות על גידולים. עכברים שהוחדרו ב-IRF8 בעל השפעה דומיננטית שלילית K79E מראים פוטנציאל מטאסטטי מוגבר של תאי הגידול.
תמונות אלו מציגות אנליזה היסטולוגית של יעילות אימונותרפיה באמצעות העברה אדופטיבית של CTL. בעכברים עם גידולים שהוזרק להם תמיס סלין, נראו מספר גידולים שישה ימים מאוחר יותר, כפי שמסומן בחצים. לעומת זאת, בעכברים שהוזרקו להם תאי T ספציפיים לגידול, נראתה הפחתה במספר הגידולים באותו ניסוי.
טיפול בדיו סין (India ink) מספק דרך פשוטה יותר למדידת היעילות של העברה מאמצת של תאי CTL. כאן, הפקעות הגידול הלבנות בריאות הנושאות גידולים מבדילות אותן בבירור מריאות שעברו בהצלחה העברה מאמצת של תאי CTL, וספירת הפקעות מאפשרת רמה של כימות שאינה אפשרית בבדיקה היסטולוגית. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לחמם את העכברים כדי להקל ולהבטיח הזרקות מדויקות יותר לווריד הזנב.
לאחר צפייה בסרטון זה, צריכה להיות לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להעריך את יעילות הטיפול באמצעות הליך פשוט זה לכימות גודל ומספר הגוממאים. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג מודל ניסויי לניתוח אינטראקציות בין תאי גידול לתאי T in vivo, תוך התמקדות בגרורות ריאה ובאימונותרפיה. הפרוצדורה כוללת השתלה של תאי גידול לעכברים וטיפול בהם באמצעות לימפוציטים T ציטוטוקסיים (CTLs) כדי להעריך את יעילות הטיפול.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- אימונותרפיה
- אונקולוגיה
- מודלים של עכברים
רקע
- גרורות גידולים מהוות אתגר קריטי בטיפול בסרטן.
- לימפוציטים T ציטוטוكسיים ממלאים תפקיד חיוני בתקיפת תאי גידול.
- הבנת האינטראקציות של תאי T עם תאי גידול יכולה לשפר אסטרטגיות טיפוליות.
- מודלים in vivo חיוניים ללימוד יעיל של אינטראקציות אלו.
מטרת המחקר
- להערכת היעילות של אימונותרפיה באמצעות העברה אדופטיבית של תאי T ספציפיים לגידול.
- להקמת מודל לחקר גרורות ריאה בעכברים.
- להדמיה וכמות של קשרי גידול באמצעות דיו סין (India ink).
שיטות שנעשה בהן שימוש
- השתלה של תאי גידול באמצעות הזרקה לווריד הזנב הצידי.
- טיפול בעכברים הנושאי גידול באמצעות CTLs ספציפיים לגידול.
- הדמיה של קשרי גידול באמצעות דיו סיני (India ink).
- מדידת גודל הגידול וכמות קשרי הגידול לצורך ניתוח.
תוצאות עיקריות
- התוצאות מעידות על יעילות הטיפול ב-CTL בצמצום גודל הגידול.
- כימות של קשרי הגידול (tumor nodules) מספק תובנות לגבי יעילות הטיפול.
- המודל מאפשר ניתוח מפורט של אינטראקציות בין תאי T לתאי גידול.
- הממצאים תורמים להבנת תוצאות של אימונותרפיה בסרטן.
מסקנות
- המחקר מבסס בהצלחה מודל עכברים לניתוח גרורות בריאה.
- העברה אדופטיבית של CTLs מראה פוטנציאל בסימון תאי גידול.
- מחקרים עתידיים יכולים להתבסס על ממצאים אלו לשיפור טיפולים בסרטן.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מודל זה מאפשר הערכה פרה-קלינית של אימונותרפיה באמצעות העברה אדופטיבית של תאי T, על ידי כימות עומס הגריעות בריאות in vivo. הוא תומך בתיקוף המטרה ובהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי קישור פעילות CTL להפחתה במספר קשרי הגומלין של הגידול. הבדיקה מספקת ביטחון חיזוי עבור מועמדים לאימונותרפיה לפני אופטימיזציה של המולקולות המובילות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופרמצבטיקה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן השערה טיפולית של סילוק גידולים בתיווך תאי T בהקשרים של גרורות.
- ערך תפעולי: מאפשר תיקוף פונקציונלי של CTLs ספציפיים לגידול כסוכנים טיפוליים.
- ערך ניבוי: תומך במיון פורטפוליו על ידי קרילציה בין מינון של CTL לבין דיכוי גרורות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: מייצר ספירות כמותיות של קשרי גידול באמצעות צביעה בדיו הודו (India ink) למדידת נקודת סיום הניתנת לשחזור.
- מדרגיות: מאפשר מידול של גרורות מינימליות עד נרחבות באמצעות הזרקה מבוקרת של תאי גידול.
- שילוב בזרימת העבודה: מפיק פלטים ויזואליים ומספריים סטנדרטיים להשוואה רב-תפקודית של אימונותרפיות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: מדמה גרורות בשלב מאוחר על ידי התמקדות במושבות בריאות, ובכך משקף את התקדמות הגרורות בבני אדם.
- המשכיות תרגומית: מקשר בין סריקת אימונותרפיה להערכת יעילות פרה-קלינית באמצעות עומס גידולי מדיד.
- החלטות מותאמות סיכון: מאפשר קביעת קריטריוני המשך/עצירה (go/no-go) בהתבסס על ספי השטפת של הפחתת הגרורות.
שילוב תהליכי עבודה (Pipeline) וזרימת עבודה
המודל משתלב ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה ועד לזיהוי מוביל (lead identification), ומספק מערכת בעלת יכולת גרורות לסריקת אימונותרפיה.
- ביולוגיה של תגליות: בודק את יעילות תאי T נגד גרורות מבוססות, ומבהיר את מנגנון הפעולה in vivo.
- סינון: מספק ספירה כמותית של קשריות ומדדי גודל לצורך דירוג מועמדים לטיפול אימונותרפי.
- אנליטיקה: מאפשר השוואה סטטיסטית של עומס הגידול בין קבוצות טיפול באמצעות ויזואליזציה מבוססת דיו.
- מחקר תרגומי: מדמה טיפול אדופטיבי של תאי T בבני אדם על ידי הערכת תנועת CTL ואינטראקציה עם הגידול בריאות.
- שימוש חוזר ארגוני: משמש כפלטפורמה רב-פעמית להערכה איטרטיבית של מועמדים לטיפול אימונותרפי.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית על ידי קישור ישיר בין עירוי CTL לנסיגה של גידולים גרורתיים.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של כימות גרורות באמצעות ניפוח בדיו, ובכך משפר את השחזוריות בין מעבדות.
- ערך אסטרטגי: מגביר את היעילות ההונית על ידי סינון מוקדם של אימונותרפיות לא יעילות בשלב הגילוי.
- השפעה על הפורטפוליו: מספק בסיס לקבלת החלטות על קידום מותאם סיכונים, בהסתמך על נתונים כמותיים של דיכוי גרורות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בהזרקה לווריד הזנב של עכברים וטיפול סטרילי בתאים.
- תלוי בגישה לצנטריפוגות, המוציטומטרים ודיו הודו לצורך ויזואליזציה.
- מחייב סטנדרטיזציה של מינון תאי הגידול וטיהור CTL בין מחקרים שונים.
- כולל שיקולי התאמה בעת מעבר למודלים שונים של גידולים או תאי מערכת החיסון.
- מוגבל על ידי ספציפיות גרורות ריאה בעכברים, אשר עשויה שלא לשקף את כל אתרי הגרורות.
