Live-תא הדמיה וניתוח כמותי של תאים אפיתל עובריים ב Xenopus laevis
23 במאי 2010
Xenopus עובריים epithelia הם מערכת מודל אידיאלי ללמוד התנהגויות התא כגון פיתוח הקוטביות ולשנות צורה במהלך המורפוגנזה אפיתל. היסטולוגיה מסורתית של דגימות קבוע ויותר כהשלמה הדמיה לחיות תאים confocal. כאן אנו מדגימים שיטות לבודד ברקמות הצפרדע לדמיין לתאי האפיתל לחיות לחיות cytoskeleton שלהם באמצעות תאים מיקרוסקופיה confocal.
המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא להדגים שיטות של דימוי חי וכביש כמותי פשוט לניתוח מורפולוגיה של תאי אפיתל עובריים. דבר זה מושג תחילה על ידי הכנת כל הכלים והמכשור. השלב השני של הפרוצדורה הוא חיתוך X explan מעוברי צפרדע והצבתם בתאים לתרבית לטווח ארוך.
השלב השלישי של הפרוצדורה הוא איסוף תמונות ברזולוציה גבוהה של תאי אפיתל בזמן אמת. השלב האחרון של הפרוצדורה הוא כימות פרטים מורפולוגיים של תאי אפיתל באמצעות Image J. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות שטחים של תאים שעוקבו ועוצמות ממברנה באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית ברזולוציה גבוהה. שלום, אני סאגר ג'ושי ממעבדת דוידסון במחלקה להנדסת ביו-בנייה באוניברסיטת פיטסבורג.
היום נדגים לכם פרוצדורה לדימוי תאים חיים ואנליזה כמותית של תאי אפיתל עובריים של Xenos lavia. אנו משתמשים בפרוצדורה זו כדי לחקור שינויים בשלד התא בזמן אמת. בואו נתחיל.
כדי להכין תאי גידול עבור animal caps, השתמשו בגריז סיליקון לאיטום של תא אקרילי מותאם אישית או של דיסקיות ניילון קטנות לזכוכית כיסוי גדולה של 45 על 50 מילימטר. הוסיפו לתא מיליליטר אחד של 1%BSA ב-one third XMBS. ציפו רסיסי זכוכית כיסוי קטנים באותו תמיסה והדגירו אותם למשך שעתיים עד ארבע שעות בטמפרטורת החדר או למשך לילה ב-4 מעלות צלזיוס.
כדי להפחית את ההיצמדות של ה-X explan לזכוכית, יש לשטוף ולמלא את התא במצע DFA. רגע לפני ההעברה של ה-xs, יש לשטוף את רסיסי כיסוי הזכוכית באותו אופן. לאחר מכן, יש להטביעם בצלחת של תרבית DFA עם עוברים שהוזרקו במיקרו-הזרקה בשלב של תא אחד עד ארבעה תאים עם ה-MR NA הרצוי עד לשלב הרצוי ב-one third XMBS. השתמש בפיפט העברה עם פתח אלכסוני כדי להעביר את העוברים לצלחת של DFA תחת מיקרוסקופ סטריאו למשקוף.
השתמשו בפינצטה כדי להוציא את העוברים לצורך כריתת ה-animal CapEx plant. השתמשו בלולאת שיער כדי לתמוך בעובר במקום אחד. השתמשו בסכין שיער כדי לבצע חתך קטן בקוטב החייתי (animal pole).
בצעו חיתוכי flick חלקים וחוזרים כדי להרחיב את החתך ולהסיר את האקטודרמה של הכובע (cap ectoderm). הוציאו שלושה או ארבעה x explan באותה דרך. השתמשו בפיפט טרנספר כדי להעביר אותם לתא התרבית המוכן.
השתמשו בלולאת השיער כדי למקם כל X explan כך שהאפיתלום פונה לתחתית התא. בעזרת פינצטה, החזיקו שבר של זכוכית כיסוי במרכזו.
טבלו את הקצוות בגריז סיליקון. הניחו פרגמנט אחד מעל כל X explan. קבעו בעדינות כל פרגמנט במקומו באמצעות נקודות קטנות של גריז סיליקון.
יש להיזהר לא למעוך את ה-X explan בכוח מופרז באופן מוחלט. מלאו את התא ב-DFA וצפו את הקצוות העליונים של התא בגריז סיליקון. לאחר מכן, אטמו את החלק העליון באמצעות כיסוי זכוכית (cover slip) בגודל 24 x 40 מילימטר.
כווננו את מפלס ה-DFA בתוך התא כדי להפחית בועות אוויר והשתמשו בנייר סופג כדי לספוג שאריות גלישה. כעת ניתן לגדל את צמחי ה-X לטווח ארוך בתוך התא האטום למשך יום אחד בטמפרטורת החדר, והביאו את העדשה של 20x של מיקרוסקופ קונפוקלי למקומה. מקמו את התא המכיל את דגימת ה-X עלבמת המיקרוסקופ והניחו משקולות איזון קטנות על התא כדי להחזיקו במקומו תחת תאורה בשדה בהיר (bright field).
כוון את המיקוד והשתמש במיקום גס כדי להדמיות את הקצוות האפיקליים של התאים השטחיים. עבור למצב פלואורסצנציה ולעדשה בעלת הגדלה גבוהה יותר. כדי לאסוף תמונות בודדות או סרטוני time-lapse של האפיתל המופרש, כוון את הגדרות הרכישה כדי להשיג את האיmage הטובה ביותר האפשרית.
עיינו בחלק הכתוב של פרוטוקול זה לקבלת טיפים על כיוונון ודימוי. שמרו על עוצמת הלייזר נמוכה ככל האפשר. צלמו תמונות או סרטוני time-lapse של ה-x explan epithelium.
יש לעיין בחלק הכתוב של הפרוטוקול להצעות בנוגע לאיסוף נתונים. ניתן לחלץ נתונים מקובצי תמונות קונפוקאליות בדרכים שונות. להלן שתי דוגמאות לאופן ניתוח קובצי נתונים באמצעות תוכנת הניתוח Image J עם תוסף bio formats.
כדי למדוד את שטח התא של תא אפיתליאלי, פתחו את תפריט ה-analyze ולחצו על set measurements. בחרו את כלי הבחירה (selection tool) מסרגל הכלים והקיפו את התא; בתפריט ה-analyze, בחרו ב-tools ולאחר מכן ב-ROI manager. כדי לפתוח את מנהל אזורי העניין (regions of interest manager), לחצו על control t.
כדי להוסיף את התווה למנהל ה-ROI, יש לבחור ולהוסיף מספר תוואים רצוי מהתמונה. לאחר מכן, לחצו על save כדי לשמור את סט ה-ROI במנהל ה-ROI. לחצו על measure.
חלון התוצאות יציג כעת את השטחים שנמדדו עבור כל ROI. כדי למדוד את העוצמה של קרום תא, בחרו בכלי הקו הישר מסרגל הכלים של ImageJ. שרטטו קו ניצב החוצה את הקרום.
לחצו על CTRL T כפי שנעשה בדוגמה הקודמת. כדי להוסיף את הבחירה למנהל ה-ROI, פתחו את תפריט ה-analyze ולחצו על plot profile כדי להפיק גרף של עוצמות יחסיות לאורך הקו. כדי לשמור את הגרף כתמונה, לחצו על save בחלון הגרף החדש שיופיע.
גררו את תפריט הרשימה לקובץ, ולאחר מכן שמרו בשם. הרגע הדגמנו כיצד לבצע דימוי חי וכמות של תאי אפיתל עובריים מתוך אקספלנט CapEx שהוצא מבעל חיים. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להוסיף אנטיביוטיקה ואנטימיקוטיקה ל-DFA. כדי למנוע צמיחה בקטריאלית ופטרית, גלו זהירות יתרה בעת לחיצה על האקספלנטים תחת לוחות הכיסוי, מכיוון שלחץ רב מהנדרש עלול למעוך את האקספלנט.
חשוב לזכור להשתמש בהגדרות אופטימליות במיקרוסקופ הקונפוקלי כדי לקבל נתוני תמונה באיכות מקסימלית. זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מדגים טכניקות של דימות חי כדי לבחון מורפולוגיה של תאי אפיתל עובריים ב-Xenopus. הוא מדגיש שיטות לבידוד רקמות של צפרדעים ולהדמיה של תאי אפיתל חיים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- ביולוגיה התפתחותית
רקע
- אפיטל עוברים של Xenopus משמש כמודל לחקר התנהגויות תאיים.
- דימוי תאים חיים משלים את ההיסטולוגיה המסורתית.
- הבנת המורפוגנזה האפיטללית היא קריטית למחקרי התפתחות.
- מיקרוסקופיה קונפוקלית מאפשרת ויזואליזציה בזמן אמת של דינמיקה תאית.
מטרת המחקר
- להדגמת טכניקות של דימוג חי (live imaging) עבור תאים אפיתליאליים.
- לכימות פרטים מורפולוגיים של תאים אפיתליאליים.
- לספק פרוטוקול לבידוד ולגידול של רקמות צפרדע.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת הכלים והמכשור עבור הדמיה.
- חילוץ רקמות מעוברים של צפרדע לצורך תרבית.
- איסוף תמונות ברזולוציה גבוהה של תאי אפיתל.
- כימות מורפולוגיה של תאים באמצעות תוכנת Image J.
תוצאות עיקריות
- התקבלו תמונות ברזולוציה גבוהה של תאי אפיתל חיים.
- ניתוח כמותי חשף שטחי תאים שעקבו אחריהם ועצמות ממברנה.
- דימוי חי סיפק תובנות לגבי התנהגות תאים במהלך מורפוגנזה.
- השיטות תוקפו עבור תרבית ארוכת טווח של רקמות צפרדע.
מסקנות
- מיקרוסקופיה קונפוקלית של תאים חיים יעילה לחקר תאים אפיתליאליים.
- ניתן ליישם את השיטות במגוון מחקרים בביולוגיה התפתחותית.
- התוצאות משפרות את ההבנה של מורפוגנזה אפיתליאלית.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
דימוי תאי חיים ואנליזה כמותית של תאי אפיתל עובריים ב-Xenopus laevis מספקים פלטפורמה דינמית לבחינת תהליכים מורפוגנטיים הרלוונטיים לגילוי מוקדם ותיקוף מטרות. מיקרוסקופיה קונפוקלית ברזולוציה גבוהה מאפשרת מדידה בזמן אמת של מורפולוגיה תאית ומיקום חלבונים, ובכך תומכת בביטחון חיזוי במודלים של ביולוגיה התפתחותית. זרימת עבודה זו מגבירה את הערך התרגומי של מערכות אפיתליאליות להפחתת סיכונים מכניסטיים ותיעוד תיקי פיתוח במחקר פרה-קליני.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר תצפית ישירה על שינויים בשלד התא ועל דינמיקה של צורת התא בזמן אמת.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות מולקולריות המעורבות במורפוגנזה אפיתליאלית.
- מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי כימות שינויים בשטח התא ובעוצמת הממברנה.
- מספק פלטפורמה לבדיקה של מסלולי התפתחות המונחית על ידי היפותזה.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מכין מערכות תאים חיים שעברו תיקוף עבור תהליכי עבודה של דימוג כמותי בהמשך השלב.
- מנstandardize את המדידה של פרמטרים מורפולוגיים באמצעות ניתוח Image J הניתן לשחזור.
- מאפשר סריקה בעלת תוכן גבוה (high-content screening) של תרכובות המשפיעות על התנהגות תאים אפיתליאליים.
- תומך ביכולת הרחבה של הבדיקה ובשימוש חוזר בפלטפורמה עבור מחקרים השוואתיים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתואם עם מודלים רלוונטיים למחלה על ידי לכידה של תהליכים אפיתליאליים דינמיים.
- מבטיח רצף משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני באמצעות פלטים כמותיים.
- מפחית סיכון ביולוגי על ידי אספקת קריאות תאיות חיזויות בזמן אמת.
- תומך בזיהוי סמנים ביולוגיים באמצעות דימוי חי של לוקליזציה של חלבונים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
שיטה זו משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת השערות מוקדמת ועד לתיקוף מודלים פרה-קליניים, תוך שימוש בדימוי תאי חיים ליצירת נתונים חסונים.
- ביולוגיה של גילוי: מאפשרת בדיקת השערות והבהרה של מסלולים באמצעות ניתוח מורפולוגי בזמן אמת.
- סריקה: מספקת תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור עבור פיתוח בדיקות והערכת תרכובות.
- אנליטיקה: מספקת מדידות מדויקות של שטח התא ועוצמת הממברנה עבור אנליטיקה השוואתית.
- מחקר תרגומי: מגשרת בין שלב הגילוי למחקר פרה-קליני באמצעות תמיכה במידול מערכות הרלוונטיות למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מכוננת פלטפורמת דימוי וניתוח הניתנת לשימוש חוזר עבור מחקרים שונים על תאי אפיתל.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזיוי ומפחית עמימות מכניסטית בביולוגיה של תאי אפיתל.
- ערך תפעולי: מקדם סטנדרטיזציה, שחזוריות ויכולת הרחבה (scalability) בזרימות עבודה של דימות תאים חיים.
- ערך אסטרטגי: מסייע בקבלת החלטות של המשך או הפסקה (go/no-go) ומשפר את היעילות ההונית באמצעות אספקת נתונים כמותיים חסונים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכון ובקידום נכסים בשלבי הגילוי.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במיקרוסקופיה קונפוקלית ובניתוח כמותי של תמונות.
- מחייב גישה למכשור דימוי ייעודי ותוכנות ניתוח (למשל, Image J).
- מצריך סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי הדימוי והמדידה.
- עשוי לדרוש התאמה למערכות מודל או לסוגי רקמות שונים.
- תלוי בתנאי תרבית אופטימליים ובטיפול זהיר בדגימות להבטחת איכות הנתונים.
