תא יחיד transfection בעוברים צ'יק
25 בספטמבר 2010
באמצעות קצה בסדר micropipettes אנו מזריקים פלסמיד דנ"א לתוך תחומי משנה של somites עוף או צינורות עצביים. ריכוז של פלסמיד מותאם לייצר תאים transfected יחיד. לאחר מכן, אנו מאפשרים לתאים להתפתח אוכלוסיות משובט.
המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא להזריק לתאים בודדים של סומיטים או צינורות עצביים של אפרוחים פלסמיד המקודד לחלבון פלואורסצנטי ירוק. פעולה זו מבוצעת תחילה על ידי מתיחת פיפטות למיקרו-הזרקה בעלות קוטר פתח קצה מתאים. השלב השני של הפרוצדורה הוא הכנת תמיסת מלאי של פלסמיד להזרקות.
השלב השלישי של הפרוטוקול הוא הכנת העוברים להזרקה. השלב הרביעי של הפרוטוקול הוא טעינת המיקרו-פיפטות ב-plasmid DNA. השלב הסופי של הפרוטוקול הוא הזרקה לרקמות הרצויות.
בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות את טווח הנגזרות במספר התאים המיוצרים על ידי תאי אב מסומנים בודדים בתתי-תחומים נבחרים של הסומייט והצינור העצבי באמצעות מיקרוסקופיה אימונופלורסצנטית. היי, אני רעל מהמעבדה של פרופסור היים במחלקה לנוירוביולוגיה רפואית באוניברסיטה העברית בירושלים. היום נראה לכם הליך להזרקת תאים בודדים של סומייטים וצינורות עצביים של עוף.
אנו משתמשים בהליך זה במעבדה כדי לחקור הפרדה של שורות בתאי מייט (mite) ובתאי צינור העצבים. אז בואו נתחיל. כדי להפיק תאים בודדים שעברו טרנספקציה בעוברים של אפרוח, התחילו במשיכת מיקרו-פיפטות. אנו מושכים את הפיפטות שלנו באמצעות מכשיר משיכה סטנדרטי מסוג Naga PP 83 עם הגדרת חום של 13.5.
יש לכייל את ההגדרה המדויקת כדי להגיע לקוטר חוד פיפטה שבין 8 ל-10 מיקרון. אנו משתמשים בסיבי צינורות זכוכית בוריסילקט בעלי קוטר חיצוני של 1 מילימטר וקוטר פנימי של 0.75 עד 0.78 מילימטר. ניתן להשתמש גם במיקרו-פיפטות זמינות מסחרית, ללא סיב בעל קוטר חיצוני של 1 מילימטר וקוטר פנימי של 0.75 מילימטר.
הפיפטים המוכנים נשמרים בתוך צלחת פלסטיק, כאשר הטיפים מוגנים ממגע עם דפנות הצלחת. כדי להכין את ה-DNA להזרקה מיקרוסקופית (microinjection), הפלסמיד הרלוונטי מותמר לתוך DH5α E. coli. למחרת, באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים, הפלסמיד מטוהר באמצעות ערכת Maxi prep; עבור הזרקות שאינן קלונליות, אנו משתמשים בריכוז DNA של 1 µg/µL.
עבור ניסויים שבהם נדרשים שיבטים בודדים, ריכוז הפלסמיד יהיה נמוך בהרבה ויש יהיה להתאימו. עבור P-C-A-G-G-F-P-A, ריכוז של 0.05 עד 0.1 microgram per microliter עובד היטב. ברגע שנקבע הריכוז האופטימלי, אנו ממליצים לדלל את כל מלאי הפלסמיד המטוהר לריכוז שנקבע מראש, במקום לדלל דגימות בודדות.
האחרון עשוי להחדיר שונות מסוימת בשיעורי ההצלחה, ככל הנראה עקב הבדלים בדרגת הטוהר ובפרמטרים אחרים, כגון היחס של פלסמיד supercoil. כדי להכין ביצי תרנגולת להזרקה מיקרוסקופית, ביצים שדגרו כשהן מונחות על הציר האורכי שלהן עד לשלב ההתפתחות הרצוי, מנוגבות ב-70% ethanol ומושארות לייבוש. לאחר מכן, יש לנקב את הקצה המחודד של הביצה בעזרת מספריים כירורגיים. באמצעות מזרק של 10 milliliter ומחט במידה 19 gauge, שואבים שני milliliters של albumin מהביצה, ואוטמים את החורים בפרפין חם לפני ההזרקה.
השתמשו במספריים כירורגיים כדי לפתוח חלון בחלקו העליון של קליפת הביצה כדי למנוע מחלקיקים לחדור דרכו. הדביקו פיסת סרט דביק מעל החלון וחתכו דרכה חור. כדי לסייע בויזואליזציה של העובר, השתמשו בנימה קפילרית שנמשחה באש ומותקנת על אספירטור כדי להזריק דיו לא רעיל, כגון pelican 17, מתחת לדרמיס שהוסר.
בשלב הבא, השג את הגישה לעובר על ידי חיתוך והרחקה של קרומי השליה ו/או קרומי השרירית (amniotic membranes) באמצעות סיכות חרקים בקוטר 0.14 millimeter המורכבות על מחזיק מחטים, כדי להטעין את ה-DNA לתוך פיפטת ה-Eloqua המשוכה, והוסף כמות קטנה של אבקת fast green באמצעות קפילרה. שאב כמות מינימלית של פלסמיד לתוך קפילרה בקוטר מתאים המחוברת לשואב (aspirator). לאחר מכן, הכנס אותה לקצה הפיפטה שנגדי לקצה המחודד, והטען את ה-DNA קרוב ככל האפשר לקצה המחודד.
בשלב הבא, חברו את הפיפטה למזרק לחץ אוויר ידני המותקן על מיקרו-מניפולטור. הפילו כמות מינימלית של לחץ במידת הצורך כדי לאפשר לתמיסת הפלסמיד להגיע לקצה הפיפטה. תמנו את הפיפטה אל תוך התווך הנוזלי של הביצה תוך הפעלת לחץ אוויר כדי למנוע סתימה של קצה הפיפטה.
ברגע שנוקב התחום הרלוונטי ברקמה, השינוי בלחץ לרוב מספיק כדי לשחרר את הפלסמיד עם ה-fast green הנראה לעין. אם הדבר אינו קורה, הפעל לחץ קל על המזרק עד שהתערובת של הפלסמיד וה-fast green נדחפת החוצה. חזור על הליך זה לאורך ציר העובר; לאחר ההזרקה ניתן להוסיף PBS.
לבסוף, אטמו את החלון בעזרת סרט דביק והחזירו את הביצים לדגירה. הימנעו מאוורור והניחו מיכלים קטנים של מים בתוך האינקובטור כדי לסייע בשמירה על הלחות ולהגדיל את התוצאות. אם אתר ההזרקה המיועד היה שטחי מספיק כדי להיות גלוי בקלות, כגון בתוך ה-dorsal somites, ה-neural tube או ה-ectoderm, ניתן למדוד את שיעור ההצלחה של הניסוי באמצעות תצפית whole mount בעזרת מיקרוסקופ פלואורסצנטי בינוקולרי.
שלב זה מועיל במיוחד להערכה אם תויכו תאים רבים מדי או מעט מדי. אם רצוי לבצע דגירה נוספת, יש להוסיף לביצה תמיסת PBS המכילה אנטיביוטיקה לאחר הצפייה ולהחליף את סרט האיטום העליון. בנוסף, ניתן להעריך את שיעור ההצלחה של ההזרקה באמצעות חיתוך סדרתי של העוברים וביצוע אימונוהיסטוכימיה.
לאחר ארבע שעות או יותר מההזרקה, מקבעים את העוברים ומעבדים אותם לחתכים בפראפין. לאחר מכן, מסירים את הפראפין מחתכים המורכבים על זכוכית ומבצעים צביעה אימונוהיסטוכימית לוויזואליזציה של החלבון המדווח; ייתכן ששיטות הגברה כגון biotin streptavidin יהיו רצויות. לבסוף, סורקים את החתכים הסדרתיים כדי לזהות תאים מסומנים במקטעים שהוזרקו.
אם בניסיונות הראשוניים מתקבלים תאים מרובים במקום תאים בודדים, יש לדלל את מלאי הפלסמיד ולחזור על התהליך עד להשגת תוצאות מספקות. בדרך כלל אנו מבצעים הזרקה אחת של P-C-A-G-G-F-P לכל סומיט (somite), כאשר המטרה היא שישה עד 12 סגמנטים לכל עובר. בתנאים אלו, ניתן לזהות אות ברור בתצפית של whole mount, שמונה שעות לאחר ההזרקה, בלפחות סגמנט אחד בעובר אחד מתוך 10.
בדוגמה זו, הוזרק פלסמיד המקודד ל-GFP לתוך so mite, וחמש שעות לאחר מכן נצפתה תא פלואורסצנטי בודד במבט whole mount של העובר המוצג כאן. כאשר נצפה העובר 24 שעות לאחר ההזרקה ל-so mite המרכזי, נצפה שםב של תאים פלואורסצנטיים בעובר בשיטת whole mount יומיים לאחר ההזרקה הקלונלית. חיתוך של סגמנט זה חושף נוכחות של צאצאים קלונליים הן בדרמיס והן בשריר, מה שמוכיח שתאי פרוגניטור בודדים מייצרים את שני הנגזרות.
בדומה לסומיטים, ניתן להחדיר מחטים גם לתאי אב נוירו-אפיתליאליים בודדים בצינור העצבי הגבי (dorsal neural tube), כפי שמוצג בחתך הרוחב זה, שצולם כאן חמש שעות לאחר ההזרקה. ניתוח של חתכים סדרתיים גילה כי השגה של טרנספקציות קלונליות התרחשה כאשר שיעור ההצלחה היה כ-10%. המשמעות היא שכדי להשיג קלונליות, הטכניקה היא מעצם הגדרתה לא יעילה ביותר. מאידך, בתנאים אלה, נמצא כי יותר מ-93% מאירועי הסימון החיוביים היו קלונליים.
הרגע הדגמנו כיצד להזריק תאים בודדים של עוברי תרנגולת בעת ביצוע פרוצדורה זו. חשוב לזכור לדלל כמות גדולה של פלסמיד מלאי לריכוז אידיאלי להדבקות של תאים בודדים, ולהשתמש בו לאורך כל הניסויים שלכם. וזהו זה.
תודה לצפייה ובהצלחה בניסוייכם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר שיטה להזרקת DNA פלסמידי לתאים בודדים של סומיטים או צינורות עצביים של עוף באמצעות מיקרופיפטות בעלות קצה דק. המטרה היא ליצור אוכלוסיות קלונאליות של תאים שעברו טרנספקציה המבטאים חלבון פלואורסצנטי ירוק.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי העצבים
- ביולוגיה של התא
- הנדסה גנטית
רקע
- טכניקות של מיקרו-הזרקה הן חיוניות לחקר תפקוד גנים.
- עוברי תרנגולת משמשים בדרך כלל כאורגניזם מודל.
- ניתן להשתמש ב-DNA פלסמיד כדי לבטא חלבונים פלואורסצנטיים לצורך ויזואליזציה.
- טרנספקציה של תא בודד מאפשרת ניתוח של אוכלוסיות תאים קלונליות.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה מהימנה להזרקת DNA פלסמידי לרקמות ספציפיות.
- יצירת תאים בודדים שעברו טרנספקציה לצורך מחקר המשך.
- הפשטה של תצפית על ביטוי גנים בעוברים חיים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנה של פיפטות למיקרו-הזרקה עם קטרי קצה מתאימים.
- הכנה של תמיסות סטוק של פלסמידים להזרקה.
- הכנה של עוברי עוף למיקרו-הזרקה.
- הזרקת plasmid DNA לסומיות או לצינורות העצביים.
תוצאות עיקריות
- הזרקה מוצלחת של DNA פלסמי לרקמות המטרה.
- יצירת תאים בודדים שעברו טרנספקציה ומתפתחים לאוכלוסיות קלונליות.
- ויזואליזציה של ביטוי גנים באמצעות חלבון פלואורסצנטי ירוק.
- ביסוס פרוטוקול למחקרים עתידיים על תפקוד גנים.
מסקנות
- טכניקת המיקרו-הזרקה יעילה עבור טרנספקציה של תא בודד.
- ניתן ליישם שיטה זו במגוון מחקרים בביולוגיה של ההתפתחות.
- מחקרים עתידיים יוכלו להתבסס על ממצאים אלו כדי לחקור תפקוד גנים in vivo.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
טרנספקציה של תא בודד בעוברים של אפרוחים מאפשרת מעקב מדויק אחר שורות תאים ומניפולציה גנטית, ובכך מסייעת באימות מטרות במסלולי התפתחות. שיטה זו מספקת הפחתת סיכונים מכניסטית על ידי קישור התנהגות תאי progenitor לתוצאות פנוטיפיות, ובכך מספקת מידע לקבלת החלטות בשלבי הגילוי המוקדמים. השחזוריות שלה וניתוח קלונאלי כמותי מגבירים את הביטחון החזוי במערכות מודל פרה-קליניות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות על ידי מעקב אחר צאצאים קלונאליים מ gez progenitors בודדים בתתי-דומיינים של הסומיט והנוירוטובול.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות ויזואליזציה ישירה של סוגי תאים נגזרים (למשל, דרמיס ושריר) ממקורות מסומנים.
- ערך אסטרטגי: מסייע במיון תיקי פיתוח על ידי השוואת אוכלוסיות קלונאליות שעברו מניפולציה גנטית לקבוצות ביקורת לצורך הערכה תפקודית של המטרה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: הכנת מערכות ביולוגיות מחוקקות לתהליכי עבודה המשכיים באמצעות טרנספקציה ספורדית של תאים בודדים בדומיינים רקמתיים מוגדרים.
- ערך תפעולי: הבטחת סטנדרטיזציה ושחזור של הבדיקה באמצעות ריכוז פלסמיד מבוקר (0.05–0.1 µg/µl עבור סימון קלונלי) ופרמטרי מיקרו-הזרקה עקביים.
- ערך אסטרטגי: שיפור המוכנות לסריקה על ידי מתן אפשרות למעקב אחר שושלות תאים (lineage tracing) בר-הרחבה ותואם-פלטפורמה על פני מספר סגמנטים עובריים (6–12 לכל עובר).
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: תואם למערכות רלוונטיות למחלות באמצעות מידול דינמיקה קלונית בעוברי חולייתנים, דבר הרלוונטי למחקר של הפרעות מולדות.
- ערך תפעולי: מבטיח רצף תרגומי משלב הגילוי ועד לאישור פרה-קליני באמצעות אימונוהיסטוכימיה וניתוח חתכים סדרתיים של מקטעים שעברו טרנספקציה.
- ערך אסטרטגי: תומך בהחלטות קידום מותאמות סיכון על ידי כימות שיעורי הצלחה קלוניים (~10% טרנספקציה, >93% קלוניאליות בקרב החיוביים) כדי לספק מידע להרחבת הניסוי.
שילוב תהליכי עבודה (Pipeline & Workflow)
שיטה זו משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת השערות בביולוגיה מוקדמת, דרך זיהוי מובילים באמצעות אנליזה תפקודית קלונלית, ועד לעבודה פרה-קלינית באמצעות מעקב פנוטיפי לאורך זמן.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות על ידי מעקב אחר שושלות של תאי אב בודדים, כדי להבהיר את הגיוון בגורל התאים בשושלות הסומיטים והפסינוראל (neural tube).
- סריקה: מספק מוכנות לבדיקה באמצעות הכנה הדירה של מיקרופיפטים (קוטר קצה של 8–10 µm) ופרוטוקולים סטנדרטיים להעמסת DNA.
- אנליטיקה: מספק פלטים כמותיים באמצעות מיקרוסקופיית אימונופלואורסצנציה וסריקת חתכים למדידת התרחבות קלונית ותרומה של תאי הנגזרות לאורך זמן.
- מחקר תרגומי: מקשר לרצף פרה-קליני על ידי מתן אפשרות להשוואה בין אוכלוסיות קלוניות שעברו מניפולציה לבין ביקורות, למשך עד שלושה ימים לאחר ההזרקה.
- שימוש חוזר ארגוני: משמש כיכולת הניתנת לשימוש חוזר במחקרי שונים הודות לזרימות עבודה סטנדרטיות של הכנת עוברים, כיול פיפטים ודילול פלסמידים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון חזוי בתיקוף המטרה, הפחתת עמימות מכניסטית ביחסי שושלות.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה, הדירות ויכולת הרחבה של טרנספקציה של תא בודד לאורך נקודות זמן התפתחותיות.
- ערך אסטרטגי: קבלת החלטות משופרת לגבי המשכה או הפסקה של פרויקטים (go/no-go), יעילות הון והפחתת סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים באמצעות פנוטיפיה קלונלית מוקדמת.
- השפעה על הפורטפוליו: תעדוף והחלטות קידום מותאמות סיכון המבוססות על מדדים כמותיים של גזירה קלונלית.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות במשיכת מיקרופיפטים ובטיפול בעוברים כדי להשיג קטרי קצה של 8–10 µm וחדירה מוצלחת לרקמה.
- הציוד הנדרש כולל מיקרו-מניפולטור, מזריק בלחץ אוויר ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית למעקב קלונאלי.
- סטנדרטיזציה בין צוותים דורשת דילול עקבי של פלסמידים (למשל, 0.05–0.1 µg/µl) ופרוטוקולים אחידים לקביעת שלב התפתחות העובר כדי להבטיח שיעורי טרנספקציה הניתנים לשחזור.
- שיקולי התאמה בין מערכות מודל כוללים התאמה של לחץ ההזרקה וריכוז ה-DNA בהתבסס על נגישות הרקמה והגאומטריה של העובר.
- מגבלות מעשיות כוללות נצילות טרנספקציה נמוכה (~10%), מה שמחייב דילול של מלאי החומר והזרקות חוזרות כדי להשיג רזולוציה של תא בודד.
