גישה גנטית הפוך כדי בדיקת יתירות פונקציונלית במהלך embryogenesis

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לקבוע אם שני גנים הם רדונטיים מבחינה תפקודית עבור קביעת שושלת תאים מוגדרת. דבר זה מושג תחילה על ידי הגדרת הפנוטיפ של אובדן התפקוד של כל גן בנפרד, באמצעות הזרקת מורפנוס ספציפיים לגנים לעוברים של דגי זברה בשלבי התפתחות. השלב השני של הפרוצדורה הוא פיתוח בדיקה לכימות של קביעת שושלת התאים או בידולה.

לדוגמה, באמצעות שימוש בזן דג רפורטר, כפי שנראה כאן. השלב השלישי של הפרוטוקול הוא שילוב של שני FENO morphs כדי להוביל לאובדן תפקוד של שני הגנים בו-זמנית. השלב האחרון של הפרוטוקול הוא הערכת הפנוטיפ הנגרם כתוצאה מה-double knockdown.

בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות אובדן או רכישת תפקוד של תאים משושלת ספציפית באמצעות בדיקת הדווח של השושלת (lineage reporter) או ניתוח ביטוי של סמן ספציפי לשושלת. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון שילוב של נוק-אאוטים (knockouts) במודל עכבר, הוא שניתן לטרגט שניים או אפילו שלושה גנים במודל הדג פשוט על ידי שילוב של מורפוסים (morphos) מתוקפים בניסוי בודד. ניתן להזריק למעלה מ-100 עוברים ולהעריך את הפנוטיפים לאורך מספר ימים.

שיטה זו עשויה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח. בביולוגיה התפתחותית, כגון בהגדרת המסלולים השעתוקיים השולטים בגורל התא, מסלולים רגולטוריים מרכזיים מיוצגים לעיתים קרובות על ידי משפחות קטנות של גנים קרובים בעלי יתירות תפקודית. לכן, תפקידם אינו ניכר במחקרי knockout בעכברים עקב פיצוי מצד גנים מקבילים (Sister Genes).

למרות שדגם זה יכול לספק תובנות לגבי העובר של דגי הזברה, ניתן להחיל את התוצאות על מערכות אחרים כגון עכבר, מכיוון שתוכניות גנטיות דומות נשמרות בדרך כלל היטב לאורך האבולוציה. הכינו פלטות להזרקה מיקרוסקופית לפני ההזרקה לעוברים. שפכו כ-12 milliliters של 2%agros בתוך system water, שהוא מים נקיים שנלקחו ישירות ממערכת מיכלי הדגים, אל תוך המכסה ההפוכה של Petri dish של 100 millimeter.

הנח שתי זכוכיות מיקרוסקופ בזווית של כ-45 מעלות בשני צדי המכסה. כאשר האגרוז התמצק, משוך בעדינות את הזכוכיות הרחק מהמכסה, ובכך צור תעלות שבהן ינוחו העוברים במהלך ההזרקה. ה-morphos stocks נשמרים בטמפרטורת החדר בריכוז של 1 mM ובמים מזוקקים סטריליים ודה-יוניים לפני ההזרקה. דגרו את ה-morphos stocks בטמפרטורה של 65 °C למשך חמש דקות כדי להבטיח שהם מומסים לחלוטין.

יש להמתין לקירור התמיסות המרוכזות לטמפרטורת החדר. יש לתקף באופן אמפירי את הפעילות ואת סבילות העוברים עבור כל morpho שתוכנן מחדש. במבחנות מיקרו-צנטריפוגה, יש לבצע אחת עד שתיים של מהלעות סדרתיות של ה-morpho המרוכז במים מזוקקים ודה-יוניים, כדי להגיע לריכוזי עבודה של 1 millimolar, 0.5 millimolar, 0.25 millimolar ו-0.125 millimolar.

תחת מיקרוסקופ סטריאומשקית, השתמשו בשאיבה כדי למלא בחזית מחט הזרקה מכוילת, המחוברת למיקרו-מניפולטור וממוקמת כראוי. מלאו את המחט בכמות של כ-1 µL מהתמיסה של morpho בריכוז הנמוך ביותר. השתמשו בפיפטת העברה כדי להעביר עוברים מופריים בשלב התא הבודד אל תעלותיה של פלטת המיקרו-הזרקה.

השתמשו בפפטה כדי להסיר עודפי מים מהפלטה כך שהעוברים יצנחו לתחתית התעלה. מקמו את פלטת ההזרקה תחת המיקרוסקופ, והורידו את המחט דרך הכוריון ואל תוך החלמון. הזריקו לכל עובר לפני הוצאת המחט ומיקום מחדש של פלטת ההזרקה כדי לגשת לעובר הבא.

בעת למידת טכניקת ההזרקה, עשיל להועיל להשתמש בצבע חי כדי להמחיש את ההזרקה לתא כפי שמוצג כאן, להעביר את העובריים חזרה לצלחת פטרי של 100 מילימטר עם מי מערכת ולגדלם בטמפרטורה של 28.5 °C. יש להוציא כל שארית של תמיסת morpho מהמחט, ולמלא אותה בריכוז הגבוה הבא של morpho לצורך הזרקה למجموعة העובריים הבאה בשלב התפתחותי מתאים. יש לבחון את העובריים כדי לזהות פנוטיפים בכל ריכוז של morpho שהוזרק.

מינון הסף עבור כל morpho הוא המינון הנמוך ביותר שבו מתקבל פנוטיפ אמין ומוגדר. ייתכן שיידרשו מספר סבבים של טיטרציה כדי להגדיר סף מדויק. זאת במטרה לחפש אינטראקציה גנטית בין שני גנים נפרדים.

הכינו תערובת של שני morphos רלוונטיים, כל אחד בריכוז הסף המתאים לו. חשוב לזכור כי ייתכן שהעובריים לא יעמדו בכמות של יותר מ-20 nanograms של morpho כולל להזרקה. הזריקו לעובריים באותה הדרך כפי שבוצע קודם לכן.

שמרו על נפחי הזרקה קבועים בין הקבוצות הניסיוניות לקבוצות הביקורת, אשר צריכות לכלול סדרות שהוזרק להן כל morpho לבדו תחת מיקרוסקופ דיסקציה. עקבו אחר העובריים המוזרקים מיד לאחר ההזרקה ובמספר פעמים במהלך היום, והשתמשו בפיפט העברה כדי להסיר עובריים מתים או גוססים. מכיוון שאלה עלולים לפגוע בחיוניותם של שאר העובריים, הסירו באמצעות פיפט העברה עובריים מרGossים או כאלו שהורדמו או הומהתו בכל שלב.

העבירו לצלייית שקע לצורך תצפית. לצילום, השתמשו בפינצטה חדה כדי להסיר את הקוריון במידת הצורך.

ייצבו את העובר בטיפה של 3% Methyl cellulose ובדקו את העוברים כדי לזהות פנוטיפ מובחן, הייחודי לשילוב של המורפנוס, בניגוד לחדירות גבוהה יותר של הפנוטיפ של מורפנוס בודדים. להלן מספר עוברים מסוג פרא (wild type) שהוזרקו במורפנוס במינון סף. עבור gata five, הפנוטיפ הטיפוסי הוא cardio bifida או שני לבבות, מכיוון שהתאים הקדמונים לא התמזגו בקו האמצע.

שימו לב לתאי שריר הלב החיוביים ל-GFP המסומנים על ידי החיצים. הפנוטיפ עבור שש דגימות מורפין כולל לבבות מעוותים שנכשלו לבצע לולאה (looping) כראוי. עוברים אלו מפתחים גם תאי שריר לב חיוביים ל-GFP.

עם זאת, העוברים שהוזרקו לשילוב של morphos של gata five ו-gata six המוצגים כאן, מראים אובדן מוחלט של התפתחות קרדיומיוציטים, מה שמעיד על כך שחייב להתבטא gata five או gata six כדי שקרדיומיוציטים יתפתחו. שני הגנים הם רדונטים תפקודית עבור התמיינות קרדיומיוציטים.

בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב תחילה לתקף באופן מלא את המורפוסים (morphos) ולוודא ככל האפשר שהם מייצגים knockdown אמיתי של הגן מטרה הבודד בעקבות פרוצדורה זו. ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון שילוב של אללים ריקים (null alleles) תנאיים בעכברים, כדי להראות שאותם גנים מתפקדים באופן דומה גם ביונקים.

לאחר צפייה בסרטון, תגיעו להבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לקבוע אם שני גנים הם רדוננטיים מבחינה תפקודית במהלך האמ בריולוגיה.