שיבוט פונקציונלי שימוש Xenopus
30 בינואר 2016
אנו מתארים מערכת ביצית Xenopus וכובע בעלי חיים לשיבוט ביטוי של גנים המסוגלים לעורר תגובה באקטודרם מוכשר, ודנים בטכניקות לניתוח מאוחר יותר של גנים כאלה. מערכת זו שימושית בזיהוי פונקציונלי של מגוון רחב של תוצרי גנים.
המטרה הכוללת של הליך זה היא להדגים ביצית Xenopus, מערכת כובע של בעלי חיים, המתאימה לזיהוי תוצרי גנים המסוגלים לעורר תגובה באקטודרם מוסמך. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה ההתפתחותית כגון אילו גנים נחוצים כדי להגיב באופן לא חוקי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא השימוש שלה בביצית Xenopus, כמערכת ביטוי, כדי לייצר ולזהות משרים הפועלים על רקמת מטרה, או אפילו גנים הפועלים במעלה הזרם של משרה.
הדגמה חזותית של שיטה זו שימושית ביותר, מכיוון ששלבי החיתוך והרקומבינציה תלויים מאוד בשלב ודורשים טכניקה מעודנת. לאחר איסוף רקמת שחלה מנקבות צפרדעים מורדמות, קרעו את הרקמה לחתיכות קטנות, שכל אחת מהן מכילה כ-10 עד 20 ביציות. והעבירו את השברים הללו, תחילה לתמיסת OR2 טרייה, ולאחר מכן ל-OR2 המכיל 2.0 מיליגרם למיליליטר קולגנאז A.המשיכו על ידי ערבוב עדין של התערובת המכילה רקמה על שייקר למשך שעה.
לאחר מכן העבירו את השברים לתמיסת קולגנאז טרייה, וערבבו במשך שעה נוספת. צפו לצפות בביציות מנוטרלות בסוף טיפול זה. המשך לשטוף את הביציות 10 פעמים ב-OR2 מלא, ולאחר מכן פעמיים במדיום תרבית ביציות, בקיצור OCM.
לאחר מכן, הניחו את הביציות ב-OCM טרי, ובדקו אותן ויזואלית תחת מיקרוסקופ דיסקציה. בודדו את אלה בשלב השישי על ידי השלכת הביציות הקטנות והלא בשלות. לאחר מכן, מניחים את הביציות בצלחת פטרי מצופה אגרוז המכילה OCM, ושומרים אותן על 18 עד 20 מעלות צלזיוס עד להזרקה.
כדי להתכונן למיקרו-הזרקה, הנח צינורות נימי זכוכית לתוך מושך מחט, משוך אותו ולאחר מכן שבור את הקצוות מהזכוכית כדי ליצור מחטים בקוטר של כ-20 מיקרומטר. במיקרוסקופ מורכב, מדוד את קצות המחט בעזרת מיקרומטר עיניים מכויל. לאחר מכן, דחפו את החימר לשכבה אחידה בתחתית צלחת פטרי בגודל 35 על 10 מילימטר.
ואז צור חריצים מקבילים בשכבה זו, באמצעות כלי דמוי בדיקה בקניון. מלאו את התבנית המרופדת בחימר בכ-2 מיליליטר של 3% פיקול במי מלח של בארת' שהשתנו פי 1, או MBS. ואז מעבירים אליו את הביציות באמצעות פיפטה רחבת קדח.
מקם את הביציות במטעים כך שיוחזקו במקומם במהלך המיקרו-הזרקה שלאחר מכן. בעזרת מיקרו-מזרק, מלאו מחט בכשני מיקרוליטר של מאגר mRNA שנוצר בעבר והתאימו את האיזון כדי לייצר לחץ חיובי קל, שימנע משיכת ציטופלזמה של ביצית לתוך המחט במהלך ההזרקה. לאחר מכן, הזריקו לכל ביצית 20 ננוליטר RNA באזור קו המשווה.
לאחר מכן, השאירו את הביציות ב-Ficoll MBS למשך שעה, ולאחר מכן העבירו אותן בעדינות ל-1x MBS. המשיכו לדגור על הביציות במשך שמונה עד 24 שעות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס. כדי להתחיל בבדיקת כובע החיה, אסוף פי 3/4 מדיום דו-חיים רגיל, בקיצור תמיסת NAM, מלקחיים עדינים, לולאת שיער, ביציות שהוזרקו בעבר ועוברי קסנופוס בשלב 11 עד 11.5.
לאחר מכן, שברו את מכסה הזכוכית לשברים בגודל של מילימטר על שני מילימטרים, והעבירו את החלקים הללו דרך להבה עד שהקצוות שלהם מלטשים ונמשכים. לאחר מכן, לחץ חימר לשכבה אחת בכלי, כפי שתואר קודם לכן. והשתמש בבדיקה של קניון כדי ליצור רשמים אישיים בצורת בציפוי זה.
המשיכו למלא את המנה בכשני מיליליטר של 3/4x NAM. ואליו, העבירו את הביציות המוזרקות, מקמו כמה כך שכל אחת מהן תשתק בכניסה אחת. כדי להכין את העוברים, העבירו אותם בכלי המכיל תמיסת NAM פי 3/4.
בחר תת-קבוצה של גסטרולה שתשמש כבקרות בימוי לגיל האקטודרם, והעביר אותם לכלי אחר המכיל את אותה תמיסה. והניחו את הצלחת הזו בצד. עבור עוברים שישמשו בכובע החיה, הסר את ממברנות הוויטלין שלהם עם שני זוגות מלקחיים עדינים.
לאחר מכן, העבירו את הגסטרולה לכלי המרופד בחימר עם הביציות. כדי להתחיל, חתכו את כובעי החיות מהעוברים באמצעות שני זוגות קדמיים עדינים, והקפידו להימנע מרקמת קו המשווה. כדי ליצור רקומביננטים בשיטה הראשונה, מקם כובעי בעל חיים כך שהמשטח הפנימי ייגע בחצי הכדור של הביצית, שכבר ממוקם בשקע.
וחזור על תהליך זה עבור כמה מהביציות המוזרקות. כדי להבטיח שהרקומביננטים הללו מוחזקים יחד, הניחו שבר כיסוי זכוכית מעוקל על גבי כל אחד מהם, והפעילו לחץ כלפי מטה עד שהחיה משוטחת והכיסוי נוגע בחימר. כדי ליצור רקומביננטים בשיטה השנייה, הניחו כובעי בעלי חיים וביציות יחד בשקעים בודדים ריקים בחימר.
וודא שהמשטחים הפנימיים של מכסי בעלי החיים פונים לביצית. לאחר מכן, אבטח את שתי הרקמות יחד באמצעות הרחבות קטנות של חימר. לאחר שנוצרו רקומביננטים מרובים בכל אחת מהשיטות, תרבית אז והעוברים המופרשים שולטים ב-20 מעלות צלזיוס.
כאשר עוברי הביקורת מגיעים לשלב הרצוי, הסר את החלקות הכיסוי מהרקומביננטים ובודד את אקטודרם כובע החיה באמצעות מלקחיים ולולאת שיער. המשך לתקן גם שברים אקטודרמליים וגם לשלוט בעוברים ב-MEMFA למשך שעה. והעבירו אותם לאתנול ואחסנו את הרקמה הזו בטמפרטורה שלילית של 20 מעלות צלזיוס.
כאן, קבוצות של ביציות הוזרקו עם מאגרי mRNA המתאימים למספר קטן יותר של שיבוטים או מושבות, ולאחר מכן, תורבבו עם כובעי בעלי חיים. לאחר מכן, נקבע מספר כובעי בעלי החיים בכל קבוצה המבטאים foxe3, סמן שנצפה בדרך כלל באקטודרם עדשה משוער משלבי צלחת עצבית מוקדמים ועד להיווצרות שלפוחית, ומשמש כאן, להערכת יכולת השראת עדשה. שיטה זו זוהתה בגן המקודד לגורם גרעיני, ldb1, שיכול לייצר תגובה מעוררת עדשה ב-50 מתוך 179, או 28% מכובעי בעלי החיים שהוערכו.
מוצגות כאן, תמונות ההכלאה שלנו באתר, המתארות את אות foxe3, המסומן על ידי ראשי חצים, בכובעי בעלי חיים שגודלו עם ביציות מוזרקות ldb1 בערך משלב 11 עד שלב 23. לא נצפה ביטוי של foxe3 בכובעי חיות ביקורת מקבילים המונחים על ביציות לא מוזרקות. כאשר נוצרו חתכים מכובעי בעלי חיים אלה, נצפה ביטוי שועל3 הן בשכבות האקטודרמיס הפנימיות והן בשכבות האקטודרמיס החיצוניות.
ביטוי בשכבה הפנימית אופייני לתגובת עדשה. או, כפי שמסומן בשתי השכבות, מעיד על מבנים אחרים כגון שלט הריח. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות כמו אימונוהיסטוכימיה, הכלאה באתר, או זיהוי ישיר של גן מדווח פלואורסצנטי, על מנת להעריך תגובה אינדוקטיבית באקטודרם של כובע החיה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר מערכת של ציטות Xenopus וכובע חיה (animal cap) לשיבוש ביטוי של גנים המשרים תגובות באקטודרמה כשירה. שיטה זו שימושית במיוחד לזיהוי תוצרי גנים ולניתוח תפקודיהם בביולוגיה של ההתפתחות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביולוגיה התפתחותית
- ביטוי גנים
- גנומיקה תפקודית
רקע
- ציותות של Xenopus מהוות מודל בעל ערך לחקר תפקוד גנים.
- מערכת ה-animal cap מאפשרת ניתוח של תגובות השראתיות באקטודרם.
- הבנת אינטראקציות בין גנים היא קריטית לתהליכי התפתחות.
- טכניקות ויזואליות הן חיוניות בשל מורכבות תהליך הניתוח.
מטרת המחקר
- זיהוי גנים המעוררים תגובות באקטודֶרמה.
- בחינת מנגנוני פעולת הגנים בהקשרי התפתחות.
- אספקת שיטה מהימנה לניתוח תוצרי גנים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- איסוף רקמת שחלה מצפרניות נקבות תחת הרדמה.
- חיתוך של הרקמה למקטעים קטנים המכילים אוקיציטים.
- שימוש ב-collagenase A כדי להקל על בידוד האוקיציטים.
- ערבוב של תערובת הרקמה לשיפור השבת האוקיציטים.
תוצאות עיקריות
- מערכת התאי ביצית של Xenopus מזהה ביעילות משרים של גנים.
- הטכניקות שהוצגו מאפשרות מניפולציה מדויקת של רקמות אקטודרמיות.
- עזרים חזותיים משפרים את ההבנה של הפרוצדורות הניסיוניות.
- התוצאות תורמות לידע רחב יותר על ויסות גנים במהלך ההתפתחות.
מסקנות
- מערכת הביציות של ה-Xenopus היא כלי רב עוצמה למחקרי ביטוי גנים.
- זיהוי משרהים (inducers) יכול להוביל לתובנות בתחום הביולוגיה ההתפתחותית.
- מחקרים עתידיים יכולים להתבסס על שיטות אלו כדי להוביל לתגליות נוספות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שיטה זו מאפשרת סריקה פונקציונלית של תוצרי גנים המעוררים תגובות השראתיות באקטודרמה כשירה, ובכך היא תומכת בתיקוף יעדים במסלולים התפתחותיים. על ידי קישור של ביטוי יתר מולקולרי למדדים פנוטיפיים בהקשר רקמתי, היא מספקת הפחתת סיכונים מכניסטית עבור היפותזות של יעדים בשלבים מוקדמים. מערכת הביטוי של ציטות Xenopus מציעה פלטפורמה ניתנת להרחבה לזיהוי רגולטורים פראקריניים, ג'וקסקריניים או תעתוקיים הרלוונטיים למסלולי העברה של אותות.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן היפותזות טיפוליות על ידי בדיקה האם גנים מועמדים יכולים להשרות תגובה התפתחותית ספציפית ברקמה נאיבית.
- ערך תפעולי: מאפשר סריקה פנוטיפית של ספריות cDNA באמצעות קריאה כמותית (ביטוי של foxe3) לצורך תיעדוף של פגיעות פונקציונליות.
- ערך מדעי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי הבחנה בין משרים הפועלים ישירות על תאי המטרה לבין כאלה הדורשים רגולטורים שמעלה או שותפי קישור.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: יוצר מערכות ביולוגיות מתוקפות (שילובי ביצית ומכסה-חיות/animal cap) עבור סטנדרטיזציה של בדיקות המשך ובדיקת הדירות.
- ערך תפעולי: מקל על הכנת מודלים של רקמות הניתנות להשראה, המתאימים לסריקה בעלת תוכן גבוה (high-content screening) של מודולטורים של אותות או מעכבי מסלולים.
- ערך מדעי: מאפשר מדידה של פעילויות סיגנלינג שאינן תלויות בליגנד או סיגנלינג ג'וקסקריני (juxtacrine), שאינן נתפסות בבדיקות של גורמים מסיסים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מעריך התקדמות התפתחותית בעקבות ביטוי-יתר או השתקה של מטרה, ובכך מספק מידע על התוצאה הפנוטיפית והמיקום במסלול הביולוגי.
- ערך תפעולי: מספק מערכת רלוונטית למחלה (כשירות אקטודרמלית) להערכת מודולציה של המטרה בהקשר פיזיולוגי.
- ערך מדעי: תומך בהתאמה של סמנים ביולוגיים תרגומיים על ידי קורלציה בין הפרעה מולקולרית לבין השראת סמני שושבת מוקדמים (למשל, foxe3).
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מיצירת השערות לגבי מטרות ועד לזיהוי מובילים (lead identification), ובמיוחד עבור מטרות הפועלות באמצעות מנגנונים חוץ-תאיים או ג'וקסקריניים (juxtacrine).
- ביולוגיה של הגילוי: מאפשרת בדיקת השערות לגבי תפקוד גנים על ידי מדידת קיבולת השראתית באקטודרמה כשירה, תוך הבהרת תפקידי המסלולים וצמצום העמימות המכניסטית.
- סריקה: מייצרת פלטים סטנדרטיים וכמותיים (אחוז כיפות החי של בעלי החיים המבטאות foxe3) התומכים בחזרתיות של הבדיקה ובאישור פגיעות (hits) לאורך קמפיינים של סריקה.
- אנליטיקה: מספקת קריאות תפקודיות המבוססות על ביטוי סמנים מרחבי וזמני, המאפשרות השוואה בין עוצמת המשרה לבין קשרי מבנה-פעילות.
- מחקר תרגומי: מקשר בין גילוי גנים מוקדם לתוצאות פנוטיפיות ברקמה מתפתחת, ותומך בהחלטות קידום מותאמות סיכון המבוססות על נאמנות השראתית.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה לשימוש חוזר לסריקת ספריות cDNA או ORF מגוונות כנגד פנוטיפים השראתיים מרובים באקטודרמה או ברקמות כשירות אחרות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי בתיקוף מטרות על ידי קישור הגנוטיפ לפנוטיפ אינדוקטיבי בבדיקה תפקודית מבוססת רקמה.
- ערך תפעולי: מקדם סטנדרטיזציה באמצעות הגדרת פרמטרים להכנת אווציטים, הזרקת mRNA ותרבית משותפת, ובכך משפר את השחזוריות בין מעבדות.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות לגבי המשך או הפסקת הפיתוח (go/no-go) על ידי סינון מטרות על בסיס יכולת אינדוקטיבית מוכחת, ובכך מפחית השקעה במועמדים שאינם תפקודיים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכון של מטרות המפגינות תגובות עקביות של השראת עדשה או תגובות רקמה אקטופיות לאורך חזרות ביולוגיות.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בהבריולוגיה של Xenopus, במיקרו-כירורגיה ובטיפול ב-mRNA לצורך בידוד והזרקה מוצלחים של ביציות.
- תלוי בציוד למיקרו-הזרקה, להכנת פלטות אגרוז ולגילוי פלואורסצנטי או כרומוגני של ביטוי סמנים.
- מחייב סטנדרטיזציה בין צוותים של שלבי התפתחות העובר, בידוד כיפת בעל (animal cap) ופרוטוקולי קיבוע כדי להבטיח עקביות של הבדיקה.
- התאמה למערכות מודל אחרות עשויה לדרוש אופטימיזציה של תנאי שיתוף-תרבית (co-culture) וחלונות כשירות של הרקמה.
- מגבלות מעשיות כוללות תפוקה נמוכה של הרכבה רקומביננטית ידנית ואת אופיים התלוי-שלב של כשירות האקטודרמה.
שאלות נפוצות בביו-פארמה
Chapters in this video
0:05
Title
0:53
Preparation of Oocytes
2:21
Injection of Library Transcripts
4:08
Preparing the Animal Cap Asssay
5:48
Generation and Culture of Recombinants
7:35
Results: Identification of a Gene Product that Elicits a Lens-Inductive Response in Animal Cap Ectoderm
9:11
Conclusion
