הקלטה התנהגות תאיים ב Myxococcus xanthus Biofilms באמצעות זמן לשגות Microcinematography

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לפתח בדיקת מיקרו-סינמטוגרפיה בשיטת time-lapse זולה, עם רמת דיוק מספקת להפקת תוצאות הניתנות לשחזור ולכימות. דבר זה מושג באמצעות שימוש באטמי סיליקון זולים וניתנים לשימוש חוזר לבניית פלטות מצע אגר או תבניות מיקרוסקופ. התוצאות המתקבלות מראות כי קומפלקסים של פלטות אלו נשארים רוויים במים ומחומצנים מספיק למשך יותר משבוע במגוון סוגי מצעים וריכוזי אגר.

בנוסף, מכיוון שצילום מיקרו-סינמטוגרפיה בשיטת time-lapse הוא תהליך איטי, שימוש בשמונה מיקרוסקופים זולים מסייע להאצת רכישת הנתונים. שלום, אני רייאן טיילור מהמעבדה של ד"ר רוי וולש מהמחלקה לביולוגיה באוניברסיטת סירקוז. היום נדגים לכם פרוצדורה ליצירת סרטי time-lapse של ביופילמים חיידקיים; במעבדה שלנו, נשתמש בפרוצדורה זו כדי לחקור התנהגות רב-תאית של ביופילמים של MTIs.

אז בואו נתחיל. כדי להתחיל בפרוצדורה זו, מדדו את צפיפות התאים של תרבית overnight של Occus sanus באמצעות מד עכירות (clut meter). העבירו 1 mL מהתרבית למבחנת צנטריפוגה של 2.5 mL, בצעו pellet, שטיפה ותליה מחדש של החיידקים במצע TPM כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב המצורף. השתמשו בפיפט ובמערבל Vortex כדי לתלות מחדש את המשקע באופן מלא, פעולה שעשויה להימשך זמן מה. לאחר מכן, הוסיפו 0.5 g של aros ל-50 mL של TPM, המשמש כמצע הבדיקה.

הוסיפו גם 0.5 grams של aros ל-50 milliliters של C-T-T-Y-E, שזהו מצע תזונתי לדיסקים המועמד לאוטוקלאב לצורך עיקר. לאחר מכן, שמרו את המצע בטמפרטורה של 55 °C בתוך אינקובטור או אמבט מים, בזמן הכנת מערך המעקב.

העבירו את קומפלקס הפלטות לבניית הדיסק התזונתי, ראשית באמצעות סטריליזציה בלהבה של זכוכית מיקרוסקופ. הניחו אטם גומי סיליקון סטרילי בעובי 0.5 millimeter על גבי העגלה. טפטפו באמצעות פיפטה כ-300 microliters של מצע C TT YE אל תוך הבאר שנוצרה על ידי האטם על העגלה.

יש להעמיד את מצע ה-C-T-T-Y-E, לעקר על ידי להבה שקופית נוספת ולהניח אותה בזווית מעל מצע ה-C-T-T-Y-E. הנחת השקופית בזווית מונעת היווצרות בועות. לאחר שהשקופית במקומה, יש להצמיד את המבנה יחד באמצעות תפסים קטנים, אחד בכל צד.

הנח את התצמיד הגזור בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס והמתן עד שהמצע C-T-T-Y-E agro יתקשה. תהליך זה אורך בדרך כלל כחמש דקות. לאחר התקשות ה-agro, ניתן להכין את תצמידי הפלטות המשמשים במבחן המעקב.

התחילו בהכנת השקופיות לבניית קומפלקסי הבדיקה. עבור כל קומפלקס, עקרו בלהבה שתי שקופיות זכוכית למיקרוסקופ. הניחו אטם של אוטוקלאב על אחת השקופיות כדי ליצור את בסיס הבדיקה.

הזכוכית השנייה משמשת ליישור ה-agros וכזכוכית תמיכה. החלק העליון של הבדיקה הוא לבישת כיסוי. ראשית עטפו זכוכית מיקרוסקופ בסרט סימון, לאחר מכן עטרו לבישת כיסוי זכוכית בלהבה והניחו אותה מעל הזכוכית העטופה והמחוטרת.

הזליגו למעלה את תומכי הזכוכית העטופים התומכים בזכוכית המכסה, כדי למנוע מהיא להיסדק. הניחו בעזרת פינצטה אטם לאוטוקלאב על גבי זכוכית המכסה שעברה סטריליזציה בלהבה. לחצו על האטמים שעל הזכוכית התחתונה ועל זכוכית המכסה כדי לוודא שהם יוצרים איטום עם הזכוכית.

אחרת, מערכי המצע עלולים להתייבש. הניחו את מכלולי אטם העגלה ואטם לביבית הצפייה בצד, כאשר הצדדים הסטריליים פונים כלפי מעלה; מכאן והלאה עבדו על קומפלקס אחד בלבד בכל פעם כדי למנוע התמצקות של מערכי המצע, מה שיוביל לאיכות סרטון נמוכה. התחילו בהנחת הדיסק התזונתי.

הוצא את קומפלקס דיסק ההזנה מטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. הסר את כיסוי החסימה וחשוף את ה-C-T-T-Y-E agar שהתגבש כעת באמצעות פיפט דגימה מיקרוסקופית עם טיפ זכוכית חד-פעמי של 100 µL. הסר דיסק הזנה בקוטר של 1 mm ממצע ה-C-T-T-Y-E agar והנח אותו בבאר שנוצרה על ידי האטם בכיסוי הזכוכית.

לאחר מכן, הוציאו את טבעות מצע ה-TPM מהאינקובטור וטפטפו 300 µL אל תוך הבאר שנוצרה על ידי האטם על ליתוש הכיסוי ומכילה את הדיסק התזונתי. טבעות מצע ה-TPM צריכות להגביה כדי להשטיח את מצע ה-T-P-M-S-A. הניחו אחת מהשקופיות שעברו סטריליזציה בלהבה וללא אטם בזווית מעל טבעות מצע ה-TPM. הנחת השקופית בזווית מסייעת במניעת היווצרות בועות.

חבקו את הקומפלקס באמצעות תפסני נייר קטנים, אחד בכל צד. הניחו את הקומפלקס המחובק בטמפרטורה של 4 °C ואפשרו למצע להתגבש. פעולה זו אורכת בדרך כלל כחמש דקות.

לאחר שהמדיה שהוכנה התגבשה, הוצא את המכלופת מתוך טמפרטורה של 4 °C. הסר את תפסני הנייר ולחץ על קצה המכלופת. כדי לשחרר את השקופית העטופה בסרט, הוצא אותה והנח אותה על השולחן לשימוש בהמשך.

לאחר מכן, השתמשו בפינצטה כחוטב. הפרידו את קומפלקס זכוכית הכיסוי, האטם ומערך המדיום מהשקופית התומכת והשליכו את השקופית התומכת. אין להשתמש בתנועת מינוף כדי להפריד את קומפלקס זכוכית הכיסוי והאטם, שכן הדבר עלול להוביל לשבירת זכוכית הכיסוי ו/או להידבקות מערך המדיום לשקופית התומכת.

לאחר הסרת שקף התמיכה, הנח את קומפלקס מערך המדיום של אטם כיסוי השקף על השקף העטוף בסרט דביק, כאשר צד האטם פונה כלפי מעלה. הנח קומפלקס זה ליד מבער כדי לאפשר לכל הלחות הנראית להתאדות מפני השטח החשוף של ה-media agros. אין להניח למדיום ה-media agros להתייבש למשך יותר מדקה אחת.

מכיוון שדבר זה עלול להשפיע על התנהגות הנחיל של M Zant, המשך לזריעת התאים על קומפלקס הבדיקה שהוכן זה עתה. לאחר שהלחות העודפת התאדתה מאטמי לבישת המצע של זכוכית הכיסוי, שאב 0.5 µL של התאים המרוכזים להנחה על המצע. שחרר את קצה הפיפטה לפני ההגעה למצע.

טיפה של תאים מופיעה בקצה התחתון של טיפ הפפיטה, מה שמקל על הפקדת התאים מבלי שהטיפ ייגע במצע הג'ל. שקע על פני השטח של הג'ל עלול לשנות את התנהגות נחיל התאים. הנידו את הפפיטה ישר למטה כדי להנחית את התאים במרחק של כ-1 מילימטר מהדיסק התזונתי המוטמע.

לאחר מכן, משוך את הפיפטה ישירות כלפי מעלה. באופן זה, ניתן להבטיח שהמרקם יהיה מעגלי. לאחר השקעת התאים, הנח את המכלול לצד המבער כדי לאפשר לנקודת התאים להתייבש למשך לא יותר מ-20 שניות.

לאחר הייבוש, יישרו את מכלול אטם העגלה המהווה את בסיס הקומפלקס עם האטם שבמכסה. החליקו את מדיה אטם acro cell complex המהווה את חלקו העליון של הקומפלקס. לחצו בעדינות כדי ליצור איטום.

נקה את פני השטח של הזקיקה והמכסה בעזרת נייר ניקיון (Kimwipe) כדי להסיר שאריות ולמנוע עיבוי. הנח את המכלול עלבמת המיקרוסקופ המחוממת מיד לאחר ניקוי הזקיקות, כאשר הזקיקה כלפי מטה והמכסה כלפי מעלה. אם נוצר עיבוי, המתן מספר שניות עם המכלול על הבמה המחוממת לפני הפעלת התוכנה לרכישת תמונות.

על מנת להכין את הסרט, בחרו בעדשה המתאימה במיקרוסקופ, 2x, 4x או 10x. הפעילו את המצלמה ואת המיקרוסקופ ובדקו את רמות התאורה כדי לוודא שהאור אינו חזק מדי. הפעילו את המחשב ופתחו את תוכנת רכישת התמונות.

לחצו על חלון התמונה החיה וכוונו את המיקרוסקופ. התמונה תיראה דומה לזו המוצגת כאן. התחילו ברכישת התמונות.

יש לוודא את המיקוד באופן קבוע במהלך השעה הראשונה, שכן האגר במצע נוטה לשקוע, מה שגורם לסטייה במיקוד. לאחר השלמת רכישת התמונות, העבירו את התמונות שנרכשו לאחסון. פרקו את מכלול העגלה על ידי השריה ב-90% ethanol למשך לילה או בצעו TOLA לאטמים לצורך שימוש חוזר.

סרט Time lapse זה מציג תאים שהוכפפו לבדיקת המעקב המתוארת כאן. קצב הצילום הוא תמונה אחת לדקה בהגדלה של 20x, וקצב ההשמעה הוא 60 תמונות לשנייה. סרט Time lapse זה מציג אוכלוסייה של תאים שבה 1% מהתאים מביעים GFP.

הסרטון הורכב על ידי מיזוג תמונות של ניגודיות פאזה (phase contrast) ותמונות פלואורסצנטיות לסירוגין. הבדיקה בוצעה על C-T-T-Y-E ב-1%Aros; קצב הלכידה הוא תמונה אחת לדקה בהגדלה של 100 x. סרטון time-lapse זה מציג את הניידות הגלישה (gliding motility) של M Anthes.

בדיקה זו בוצעה ב-C-T-T-Y-E ב-1%Aros; קצב הלכידה הוא תמונה אחת לדקה בהגדלה של 100 x. סרטון TimeLapse זה מראה תנועתיות twitching של P OSA. בדיקה זו בוצעה ב-LB ב-1%Aros; קצב הלכידה הוא תמונה אחת לדקה.

בהגדלה של 20 x קצב השמירה הוא 60 תמונות לשנייה. סרט time lapse זה מציג מוטיליות של נחילים של Smar senses. בדיקה זו בוצעה על LB ו-1%Aris, כאשר קצב הלכידה הוא תמונה אחת לדקה.

בגדלה של 20x קצב ההשמעה הוא 60 תמונות לשנייה. סרט time lapse זה מציג ניידות החלקה של EGT. בדיקה זו בוצעה ב-LB ב-0.5%Tag קצב הלכידה הוא תמונה אחת לדקה ובגדלה של 20x קצב ההשמעה הוא 120 תמונות לשנייה בשל שבירותו של 0.5%arose ב-lv.

בדיקה זו משתמשת באטמים הגדולים יותר הנראים באיור 1 B. כעת הצגנו כיצד להפיק סרטוני time-lapse של ביופילם חיידקי. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לפעול בנינוחות ולהיות מדויקים ככל האפשר כדי להשיג תוצאות עקביות.

זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.