Visualisation וכימות של אינטראקציות תאיים של Neisseria meningitidis ואת האדם α-actinin על ידי הדמיה confocal

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא להעריך את רמת הקולוקליזציה (colocalization) של חיידקים שהפנימו, RIA Meningitidis, עם חלבון השלד Alpha Actinin. דבר זה מושג על ידי הדבקת תאי מיקרו-כלי דם מוחיים אנושיים מתרבות בתרבית לילה של חיידקים למשך שלוש עד שמונה שעות, כדי לאפשר לחיידקים להיכנס לתאי המטרה. כשלב שני, תאים עם חיידקים תוך-תאיים נשטפים, מקובעים ולאחר מכן עוברים פרמיליזציה (permeation), פעולות המכינות את התרבית המודבקת לצביעה אימונולוגית של החיידקים שהפנימו ושל alpha actinin תוך-תאי.

בעקבות הדמיה קונפוקלית ושימוש בתוכנה לקולוקליזציה, ניתן להבחין בתמונות של קולוקליזציה תו-תאית ולהשיג תוצאות כמותיות המראות כי Meninga Croci המבטא OPC וכן חלבון ממברנה יכולים להקיים אינטראקציה ספציפית עם אלפא-אקטנין תו-תאי, זאת על בסיס ויזואליזציה מיקרוסקופית קונפוקלית ובניתוח קולוקליזציה כמותי. שלום, אני איזל מריה מהמעבדה של פרופסור מטה TI במחלקה לרפואה תאית מולקולרית באוניברסיטה של ברי. היום נדגים לכם פרוצדורה להערכת רמת הקולוקליזציה, יחס החלבונים של חיידקים תו-תאיים עם חלבוני השלד התאי.

אנו משתמשים בנוהל זה במעבדתנו כדי לחקור אינטראקציה של mycelium meningitis המבטא חלבון ממברנה עצמי OPC עם החלבון השלדי alpha actin. אז בואו נתחיל. עבודה זו חייבת להתבצע במעבדה בטיחותית מתאימה.

יומיים לפני הליך הצביעה האימונוהיסטוכימית, זרע את זן החיידקים הרצוי על מצע Brain Heart Infusion. את צלחות האגר, המועשרות ב-10% דם סוס מחומם, גדל למשך לילה בטמפרטורה של 37 °C ובאטמוספירה של 5% carbon dioxide ביום שלפני הצביעה האימונוהיסטוכימית. השתמש בלולאת תרבית של 10 µL כדי להכין תרחיף של תרבית החיידקים שגדלה למשך הלילה.

בשני מיליליטר של PBSB, השאר את התרחוף למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר כדי לאפשר לצבירי חיידקים גדולים לשקוע. לאחר מכן, העבר את המיליליטר העליון של התרחוף לשפופרת סטרילית מבלי להפריע למשקע. המס את החיידקים על ידי הוספת מיליליטר אחד של 1% SDS ו-0.1 מולארי נתרבן (sodium hydroxide) לשתי בקבוקונים המכילים 20 מיקרוליטר של תרחוף חיידקים, והפוך את השפופרת כדי לערבב. להערכת מספר החיידקים.

מדוד את תכולת החומצות הגרעיניות על ידי קביעת הבליעה (absorbance) של התמיסה. ב-216 anters כוון את צפיפות התרחיף החיידקי לדחיסות הנדרשת במצע ההדבקה להדבקת תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים של המוח האנושי. תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים של המוח האנושי או H-B-M-E-C-A שנזרעו יומיים לפני הצביעה האימונו-כימית; הנח כיסויות זכוכית של 16 מילימטר לתוך בארי של פלטת 12 בארי וזרע HBME seas בצפיפות של 50% Confluence על הכיסויות. דגור למשך הלילה בטמפרטורה של 37 °C באטמוספירה של 5% carbon dioxide ביום למחרת.

הדביקו את התאים באמצעות תרחיף החיידקים שהוכן זה עתה במעבדתנו. באופן שגרתי נעשה שימוש ביחס הדבקה של 200 עד 300 colony forming units לכל תא מטרה. דגרו במשך שלוש עד שמונה שעות ב-37 °C ב-5% carbon dioxide בסיום תקופת ההדבקה.

שטפו את התאים שלוש פעמים עם PBS וקבעו אותם באמצעות 500 microliters של 2% para formaldehyde למשך 30 עד 45 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר שטיפת ה-para formaldehyde, בצעו פרמבליזציה לתאים שקובעו ב-paraldehyde על ידי דגירה ב-0.1% Triton X 100 המדולל ב-PBS למשך 10 דקות. לבסוף, שטפו את הדגימות שלוש פעמים עם PBS והמשיכו לצביעה אימונוכימית כפי שמוצג. לאחר מכן, ניתן לבצע צביעה של חיידקים תוך-תאיים ושל actinin בו-זמנית.

בפלטות בעלות 12 בארות, חסמו את כיסויי הזריקה (cover slips) המכילים את התאים המהמעפירים באמצעות 500 µL של 3% B-S-A-P-B-S-T למשך 30 עד 60 דקות. בטמפרטורת החדר, לאחר שטיפה ב-PBS, העבירו כל כיסוי זריקה לבארה יבשה חדשה בפלטה בעלת 12 בארות. הוסיפו את הנוגדנים הראשוניים נגד חיידקים ונגד alpha actinin בו-זמנית; 80 עד 100 µL של נוגדן לכיסוי זריקה אחד מספיקים, בתנאי שמוסיפים אותם בזהירות כך שיכסו את פני השטח של כיסוי הזריקה. דגרו למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. בתום הדגירה, הוסיפו 200 µL של PBS לבארה, הרימו את כיסוי הזריקה והניחו אותו בבארה חדשה המכילה 500 µL של PBS. לאחר חמש דקות, הסירו את ה-PBS באמצעות פיפטה ולאחר מכן הוסיפו PBS רענן. חזרו על הפעולה פעמיים והעבירו את כיסויי הזריקה לבארה יבשה חדשה.

בשלב הבא, הוסיפו את הנוגדנים המשניים המתאימים המצומדים לפלואורוצרומים שונים, המדוללים ב-1% B-S-A-P-B-S-T. הדגרירו בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת בחושך. בסיום ההדגירה, בצעו שטיפה כפי שהודגם קודם לכן, ולאחר מכן צבעו את ה-DNA עם DPI למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר בחושך. בסיום הדגירה זו, שטפו את כיסויי הזכוכית (cover slips) ב-PBS פעם אחת, ולאחר מכן קבעו אותם באמצעות טיפה של תמיסת קיבוע (mounting medium). יש לאחסן את כיסויי הזכוכית המקובעים בחושך עד לרגע התצפית. תחת המיקרוסקופ, נצפה ונדגום תמונות של הדגימות המסומנות אימונולוגית באמצעות מיקרוסקופ סריקה לייזרי קונפוקאלי המחובר למיקרוסקופ אפי-פלואורסצנטי הפוך.

כדי להתחיל את הליך ה-CLSM, הניחו טיפת שמן טבילה על העדשה והניחו את שקופית הדגימה עם כיסוי השקופית על במה המיקרוסקופ, הגדירו את המיקרוסקופ למצב ראייה ואתרו את האזור המעניין באמצעות העיניות של המיקרוסקופ. כעת ניתן להשתמש בתוכנת Leica. בחרו במצב רכישת XY z. בחרו בפורמט 512 על 512 למחקרי קולוקליזציה.

ככל שהרזולוציה גבוהה יותר, כך התמונה מדויקת יותר. לאחר מכן, בחרו במצב X דו-כיווני (bidirectional), שיגביר את מהירות הסריקה ויסייע בהפחתת פוטו-בליצ'ינג (photo bleaching). הגדירו הגדרות לסריקה סדרתית.

לחצו על פונקציית ה-SEC ולאחר מכן בחרו בין הקווים. בחרו את קרני הלייזר בהתאם לפלואורוכרומים המשוררים לנוגדנים המשניים. 405 ננומטר עבור DPI, 488 ננומטר עבור Alexa Fluor 488 ו-561 ננומטר.

עבור TriXY, הפעילו את שפופרות הכפלה פוטונית אחת, שתיים ושלוש בהתאמה. הגדירו את הגבול העליון והתחתון של ה-Z stack או הסדרה. לאחר מכן, הגדירו את גודל הצעד של ה-Z ל-0.2 micrometers.

RIA Mencius הוא diplo occus, ומכיוון שלכל caucus יש קוטר מקורב של 0.5 micrometers, גודל צעד Z של 0.2 micrometers מגביר את ההסתברות לסרוק כל caucus לפחות פעמיים. הגדירו את פרמטרי הסריקה הסופיים על ידי בחירה בממוצע קווים של שלושה כדי לשפר את יחס האות לרעש, ולאחר מכן לחצו על start. תמונות בעלות צביעה כפולה או משולשת מתקבלות על ידי סריקה רצפית באורכי גל שונים ושימוש במצב between lines עבור כל ערוץ, כדי למנוע crosstalk בין הכרומופורים השונים.

כדי להוכיח קולוקליזציה (מיקום משותף) של שני פלואורוכרומים, בחרו בפונקציית ה-overlay כדי למזג את הערוצים שנבחרו לתמונה אחת. לדוגמה, כאשר both Alexa 488 ו-trissy Fluor Chromes מראים קולוקליזציה, צבע צהוב יופיע בתמונת ה-overlay. לצורך שחזור דו-ממדי (2D) הדרוש להדמיות של קולוקליזציה אפשרית, רכבו Z-stack או סדרה באמצעות פונקציית ההשלכה המקסימלית (maximum projection). לאחר רכישת ה-Z-stack או הסדרה, עבדו את הנתונים כדי להפיק תמונה אורתוגונלית להדמיה של הלוקליזציה התו-תאית של רכיבים שונים.

כימות של קולוקליזציה (colocalization) מבוצע באמצעות תוכנת Vol CityK מהספק IMP. כדי להתחיל, צור ספרייה עם תמונות CLSM, ובחר באפשרות "extended focus" מהתמונה בסרגל העליון. כלי זה ישלב שכבות (Z-stacks) לתמונה דו-ממדית לצורך ניתוח.

כעת בחרו את כלי ה-COLOCALIZATION. לשני הערוצים שינותחו צריכה להיות אותה עומק צבע. בחרו את האזור שיועבר כימות.

הגדירו את הסף (threshold) כדי להסיר כל רעש רקע. צרו פלט של קולוקליזציה (colocalization) על ידי בחירה ב-generate colocalization. סטטיסטיקות קולוקליזציה יופקו עבור אזורי העניין (ROIs) שנבחרו קודם לכן.

בשלב הבא, בחרו את מקדמי מנדר (mander's coefficients) R ו-ny. לבסוף, ייצאו את ערכי הסטטיסטיקה למסמך Excel לצורך הצגת הנתונים. כאן מוצגות תוצאות דימוי קונפוקאלי מייצגות של תאי אנדותל של המוח האנושי שהודבקו ב-meninga cockeye למשך שמונה שעות. מיקום החיידקים מסומן בצבע אדום.

בעוד שמיקומו של alpha actinin מוצג, חצים ירוקים מצביעים על אזורים שבהם נראה כי התרחש מיצוב גבוה של alpha actinin מסביב לחיידקים. בתמונת השכבה העליונה זו, קיימים מספר אזורים שבהם מופיע צבע צהוב-כתום, המצביע על קולוקליזציה בין meninga occi לבין alpha actinin. בתמונה הבאה, ניתוח אופטי של שכבת H-B-M-E-C נגועה מעיד על קולוקליזציה מסביב לחיידקים תוך-תאיים הממוקמים בבסיס התא.

בעת עיבוד תמונות תלת-ממדיות של שכבות מונו-שכבה של H-B-M-E-C מזוהמות, מבט אלכסוני על פני השטח האפיקליים מראה חיידק Durant שצבעו אדום, המצוין על ידי החץ האדום, בעוד שחיידקים מספרים הממוקמים לכיוון המשטחים הבזאליים של תאי האנדותל מצוינים על ידי החץ הצהוב. מיקום בזאלי בעל צבע כתום-צהוב מובחן ניתן להבחנה בצורה ברורה יותר בחתך XZ זה. בניגוד לכך, ניסיויי actinin שבהם בוצע סימון של חיידקים שהפנימו יחד עם menton או actin, חושפים קולוקליזציה מזדמנת עם actin אך קולוקליזציה נדירה עם fermenting בתאי H-B-M-E-C.

כפי שנצפה בניסויים הקודמים, Retin ריכז סביב מספר חיידקים שהפנימו, כפי שסומן בחצים הלבנים. הנתונים נותחו גם כדי לקבל חפיפה יחסית. מקדם R, אשר לפי Manda מייצג את מידת הקולוקליזציה האמיתית, כלומר מספר הפיקסלים המראים קולוקליזציה ביחס למספר הפיקסלים הכולל, וערכי NY עבור alpha actinin, menting ואקטין באופן כללי ב-H-B-M-E-C שזוהמו במנינגוקוקים המבטאים OPC, הראו חפיפה של Retin במנינגוקוקים הגדולה מ-25%.

המקדם Y הוא מדד לתדירות שבה אות ה-rein השכיח יותר מופיע בכל פעם שמופיע אות ה-meninga cocoa השכיח פחות. מדד זה מראה רמה בולטת של הופעת alpha actinin בסביבת meninga cockeye שהופנמו. אנו מראים לכם כיצד להדמיות ולכמת את השילוב של חיידקים שהופנמו עם רכיבי השלד התאי בניסוי זה.

חשוב לזכור להקפיד על פרוטוקולי הקיבוע והצביעה העקיפה כדי לשמור על שלמות המבנים ולמנוע רעש רקע גבוה. זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.