הדמיה כרונית של עכבר-Visual Cortex שימוש ההכנה סחוט הגולגולת
25 באוקטובר 2010
בחומר וידאו משלים זה, אנו מראים פרוטוקול עבור כרונית In vivo הדמיה של המוח שלם באמצעות הכנה דליל-הגולגולת.
קוצים דנדריטיים הם בליטות ממברנה מהדנדריט של נוירון המקבלות קלט סינפטי. התארכות, התכווצות, הופעה או היעלמות של קוצים מתרחשות בתגובה לשינויים בתפקוד הרשת העצבית הנובעים מדפוסים ספציפיים של פעילות עצבית. תופעה זו ידועה כפלסטיות קורטיקלית, המשמשת לצפייה בשינויים מורפולוגיים בקוצים דנדריטיים.
בבעלי חיים חיים, לוח דימוי מוצמד לגולגולת של עכבר. אזור בגולגולת מודק surgically ונדרשים תמונות בהגדלה נמוכה וגבוהה. האזורים נסרקים שוב בנקודות זמן מאוחרות יותר.
התוצאות שהתקבלו מראות כי ניתן להדמיות באופן ברור את מורפולוגיית הקוצים הדנדריטיים באמצעות הכנת גולגולת דקה בנקודות זמן מרובות. כמו כן, מורפולוגיית הקוצים היא פלסטית מאוד, ומציגה שינויים במבנה וכן הופעה והיעלמות של קוצים דנדריטיים. שלום, אני אמילי קלי מהמעבדה של אנאיה מאקה במחלקה לנוירוביולוגיה ואנטומיה באוניברסיטת רוצ'סטר.
היום נדגים את ההליך לצילום כרוני של קורטקס הראייה בעכבר בעקבות הכנה מסוג חלון קריסטלי. אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי לחקור את קצב התחלופה של קוצי דנדריטים. אז בואו נתחיל.
התחילו את הפרוצדורה בסטריליזציה של הכלים לניתוח אספטי. לאחר מכן, סטריליזו את מרחב העבודה באמצעות 70% ethanol וכסו את משטח הניתוח בבתחבשה נקייה. נטרו את עומק ההרדמה בעכבר שהורדם באמצעות תערובת פנטניל על ידי בדיקת תגובתו לצביטה בבוהן; העכבר המוצג כאן הוא עכבר טרנסגני A-G-F-P-M שבו מבוטא GFP.
בשכבה חמישה קיימים תאי פרא-מטאלים השולחים שלוחות דנדריטיות לשכבות השטחיות. כדי לשמור על טמפרטורת גוף של 37.5 °C, הניחו את בעל החיים על שמיכת חימום ועקבו אחריו באמצעות מדחום רקטלי מחובר. לאחר מכן, מרחו משחה עינית על העיניים באמצעות מספריים כדי למנוע את התייבשותן.
הסר את הפרווה מהחלק האחורי של ראש העכבר, מאזור מאחורי האוזניים ועד העיניים. לאחר מכן, נקה את חלקו העליון של ראש החיה באמצעות יישום של 70% ethanol, ולאחר מכן קרצוף ב-Betadine ותמיסת Betadine. בצע חתך LCU מאחורי האוזניים וסבב לאורך הצד הימני או השמאלי של קו האמצע, בהתאם להמיספירה שצולמה, עד לעיניים, וקפל את העור הרחק מאזור הניתוח.
אין להסיר את העור, שכן הוא ייסגר מאוחר יותר באמצעות תפרים בעזרת פינצטה עדינה. משכו בעדינות את העור כלפי מעלה והרחיקו אותו מאזור העניין. בעזרת פינצטה נקייה, גרדו בעדינות את הפריאוסטאום (periosteum) מהאזור החשוף של הגולגולת.
מרחו כמות קטנה של תמיסת fair chloride בריכוז 10% על הגולגולת כדי לייבש לחלוטין את קרומי הפריאוסטאום (periosteum) ולוודא שהם הוסרו במלואם. חשוב שהגולגולת תהיה יבשה לחלוטין. כדי להבטיח הידבקות תקינה של הדבק, גרדו בעדינות את שאריות קרומי הפריאוסטאום היבשים באמצעות להב מיקרו-כירורגי.
בשלב הבא, מרחו שכבה דקה של דבק אקרילי מסוג Sano מסביב לחלון ההדמיה של לוחית הראש מנירוסטה והצמידו את הלוחית לגולגולת. בעזרת הקצה העץ של מקל צמר גפן, מרחו דבק בתפרים הפנימיים של חלון ההדמיה, תוך הקפדה על מילוי כל הרווחים שבין לוחית ההדמיה לקימור הגולגולת. טפטפו טיפה של מאיץ דבק אל תוך החלון.
לאחר מכן, נגבו במהירות את העודפים. המתינו לייבוש מלא של הדבק. באמצעות מקדח שיניים המצויד בקוצב (burr) מפלדת אל-חלד בקוטר 0.7 millimeter, התחילו לדלל את הגולגולת בחלון הדימוי.
בצע קידוח לסירוגין עם יישום מזדמן של 0.9% sterile saline, כדי למנוע יצירת חום רב מדי על הגולגולת. דקק חלון של ארבעה על ארבעה מילימטרים בגולגולת באמצעות תנועות קטנות על פני שטח הגולגולת.
בעזרת מקדחת שיניים. יש לבדוק את עובי הגולגולת באמצעות פינצטה בעלת קצה קהה. פני השטח של הגולגולת ישקעו מעט תחת לחץ עדין.
עובי הגולגולת האופטימלי לדימוי הוא בין 10 ל-30 מיקרון. לאחר דילול הגולגולת, נקה את החלון משאריות פסולת והנח תמיסת סלין על הגולגולת. צלם את חלון הדימוי באמצעות מצלמה דיגיטלית המורכבת על מיקרוסקופ דיסקציה.
כלי הדם במוח בתצלום זה יסייעו באיתור המיקום להנחת לוח הדימות עבור מפגשי דימוי עוקבים. העבירו את בעל החיים למערך הדו-פוטון. בעל החיים צריך להישאר על שמיכת החימום ויש לנטר את טמפרטורת הגוף באופן רציף לאורך כל מפגש הדימוי.
מיקרוסקופ דו-פוטוני עם לייזר mi tai. נעשה שימוש במשאבה במצב מוצק בהספק 10 watt להשגת עוצמה מקסימלית וביחידת קונפוקלית flow view של Olympus שעברה התאמה. המערכת מותאמת לדימוי של רקמות עמוקות, וגלאים חיצוניים מותקנים קרוב ככל האפשר לעדשה כדי לאפשר זיהוי מקסימלי של פלואורסצנציה מהמוח; יש להוסיף טיפה של תמיסת סליין לחלון הדימוי תוך שימוש בזום דיגיטלי נמוך.
זהה אזור המכיל נוירונים המסומנים בצורה בהירה באמצעות מצלמה דיגיטלית המחוברת למיקרוסקופ. לאחר מכן, צלם את אזור הדימוי. פעולה זו נחוצה כדי לחזור לאותו מיקום דימוי בנקודת זמן עוקבת.
השיגו סדרת תמונות (stack) בהגדלה נמוכה לאורך כל ההיקף הנראה של המוח, המציגה את מידת הסתעפות הדנדריטים. סדרה זו תשמש לאיתור אזור הדימות בנקודות זמן עוקבות, שכן הן כלי הדם והן הדנדריטים שומרים על מבנהם בבעלי חיים צעירים ובוגרים באמצעות תוכנת דימוי.
הגדילו את ההגדלה הדיגיטלית פי שמונה, התאימו את קואורדינטות XY במידת הצורך, ואספו סדרת תמונות (stack) בהגדלה גבוהה, אשר תציג מורפולוגיה דנדריטית מפורטת, כולל המיקומים והמבנה של קוצים דנדריטיים. רשמו הערות מפורטות לגבי כל איסוף סדרה, כולל קואורדינטות ניווט (pan), טווח האיסוף, גודל צעד ה-Z ומספר הצעדים בסדרה. הערות אלו ישמשו בעת החזרה לדנדריט או לאקסון זה בנקודת זמן מאוחרת יותר.
לאחר הדמיון, הסר את פלטת הראש על ידי הפרדה עדינה שלה מפני השגולגולת. בעזרת פינצטה, הסר שאריות דבק ונגב את הגולגולת עם סליין סטרילי 0.9%.
תפרו את העור מעל הגולגולת באמצעות חוט תפר מספר 6. נגבו את האזור ב-70% ethanol לאחר סיום הליך הדימוי. הניחו את החיה בכלוב נקי תחת מנורת חימום עד להתעוררותה ויכולתה לנוע.
לאחר מכן, החזירו את בעל החיים לכלובו המקורי כדי לדמות אותו שוב בנקודת זמן מאוחרת יותר, בטווח של יומיים עד מספר חודשים; הסירו את התפרים ופתחו מחדש את העור באזור הראש. בשימוש בשיטות אספטיות, השתמשו בתמונה הדיגיטלית של כלי הדם במוח שצולמה במהלך הניתוח הראשון כדי לאתר את מיקום הדימוי המקורי. לאחר מכן, קבעו מחדש את לוחית הראש כפי שנעשה בעבר.
השתמשו בלהב מיקרו-כירורגי כדי לדלל בעדינות כל עצם שייתכן שצמחה מחדש בין נקודות הזמן של הדימות, במידת הצורך. דללו באמצעות מקדחה דנטלית, נקו את חלון הדימות משאריות והחילו טיפה של 0.9% sterile saline. העבירו את בעל החיים למיקרוסקופ דו-פוטוני ואתרו את אזור הדימות המקורי באמצעות התמונה הפלואורסצנטית הדיגיטלית שצולמה במהלך הסשן הקודם.
הפעל את תוכנת תצוגת הזרימה. פתח את תמונת המקור בהגדלה נמוכה, הצמד דף שקיפות למסך המחשב ושרטט את דפוס כלי הדם העיקריים באמצעות טוש שקיפות. לאחר מכן, פתח את התמונה בשידור חי ויישר מחדש את כלי הדם בהתאם לדפוס ששורטט על דף השקיפות.
הסיר את דף השקיפות כדי לצלם מחדש את המבנים במגדילה של שמונה פעמים. פתח את ערימת התמונות (stack) הרצויה שנאספה במפגש הצילום הקודם. שרטט את המבנה על דף שקיפות המודבק למסך המחשב.
בצעו הגדלה של פי שמונה (8x) מהתמונה החיה ויישרו את התמונה עם השקיפות. בהתאם לדיוק של יישור המיקום בהגדלה נמוכה, ייתכן שיהיה צורך לכוון מעט גם את זווית התמונה. הגדירו את קואורדינטות הסריקה (pan) לפרמטרי ההדמיה של היום הראשון, כולל גודל הצעד ומספר התמונות לאיסוף. ניתן לבצע את הדמיות ה-Z-stack פעמיים. יש להגביל את מספר הפעמים שבהן נפתחת הקרקפת כדי למנוע פגיעה בשלמות הגולגולת, דבר שיוביל לרזולוציית הדמיה נמוכה בעכברים המבטאים GFPM.
תת-קבוצה של תאי parametal בשכבה חמש ותהליכים דנדריטיים תואמים הודגמו באמצעות מיקרוסקופיה סורקת דו-פוטונית in vivo; כאן מוצגים דנדריטים של קליפת המוח הוויזואלית המסומנים ב-GFP. תמונה זו היא היטל של תמונה בודדת שהושגה בכל 5 µm מה-PIA ועד לעומק סופי של 175 µm. האזור הממסגר מוצג כאן בהגדלה גבוהה יותר ביום אפס, ושוב כאן ביום רביעי; מוצגת השוואה של הגדלה גבוהה יותר של תמונה של ענף דנדריטי מיום אפס ומיום רביעי.
תמונות אלו מדגימות קוצים יציבים המסומנים בחצי חצים לבנים, קוצים נסוגים שאבדו המסומנים בחצי חצים אדומים, וקוצים חדשים המסומנים בחצי חצים ירוקים. כעת הצגנו בפניכם כיצד לבצע דימיון כרוני בדו-פוטון בקליפת המוח הראייתית של עכבר באמצעות הכנה של גולגולת דקה. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להקפיד במיוחד במהלך תהליך הדילול כדי למנוע נזק לגולגולת ולדורה שמתחתיה, שכן הדבר יגרום לרזולוציית דימיון נמוכה, וכן לרשום הערות מפורטות.
זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
סרטון זה מציג פרוטוקול לדימות כרוני in vivo של המוח השלם באמצעות הכנה של גולגולת מדוקקת. השיטה מאפשרת מעקב אחר דינמיקה של קוצים דנדריטיים בבעלי חיים חיים, ובכך תורמת להבנתנו את הפלסטיות הקורטיקלית.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- דימות מוחי
- פלסטיות קורטיקלית
רקע
- קוצים דנדריטיים חיוניים לקלט סינפטי בנוירונים.
- שינויים במורפולוגיה של קוצים (spines) קשורים לפעילות עצבית ולפלסטיות.
- טכניקות של דימות כרוני מאפשרות את חקר השינויים הללו לאורך זמן.
- הכנת הגולגולת המודקקת מאפשרת הפרעה מינימלית למוח.
מטרת המחקר
- להדגים שיטה לדימות כרוני של המוח.
- לתצפת על שינויים מורפולוגיים בקוצים דנדריטיים.
- להעמיק את ההבנה של מנגנוני פלסטיות קורטיקלית.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- הכנת גולגולת מדוקקת בגולגולת של עכבר.
- הצמדת פלטת דימוי לצורך דימוי חי.
- דימוי בהגדלה נמוכה וגבוהה כאחד.
- ביצוע דימוי חוזר בנקודות זמן מאוחרות יותר להערכת שינויים.
תוצאות עיקריות
- דימות כרוני מוצלח של קוצים דנדריטיים in vivo.
- תצפית על דינמיקת קוצים בתגובה לפעילות עצבית.
- ראיות התומכות בתפקידה של פלסטיות קורטיקלית.
- הדגמת יעילותה של שיטת דילול הגולגולת.
מסקנות
- הכנת גולגולת דקה היא שיטה יעילה לדימות מוחי כרוני.
- טכניקה זו מאפשרת לחקור שינויים בקוצים דנדריטיים לאורך זמן.
- הממצאים תורמים להבנת הפלסטיות העצבית.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
דימות כרוני in vivo של קליפת המוח החזותית בעכברים באמצעות הכנת גולגולת מודקת מאפשר מעקב אורך של דינמיקת קוצים דנדריטיים עם הפרעה מינימלית לרקמה. גישה זו מספקת תובנות כמותיות ברזולוציה גבוהה על פלסטיות סינפטית, התומכות בהפחתת סיכונים מכניסטיים ובתיקוף מטרות בקווי תגליות הממוקדים בנוירוביולוגיה. השחזוריות של השיטה והפלישה המינימלית שלה הופכות אותה לבעלת ערך עבור צוותי מו"פ בארגונים המחפשים ביטחון ניבוי במעורבות מטרות ב-CNS ובמחקרי פלסטיות.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר ויזואליזציה ישירה של שינויים מבניים סינפטיים בתגובה למניפולציות ניסיוניות.
- תומך בתיקוף תפקודי של מטרה על ידי הצלבה של התערבויות מולקולריות עם עיצוב מחדש של קוצים דנדריטיים.
- מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי אספקת ראיות לפלסטיות של מעגלים עצביים לאורך זמן.
- משפר את הביטחון החזוי לבחירה ותיעדוף של מטרות במערכת העצבים המרכזית (CNS).
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- מקימה פלטפורמה מתוקפת ובעלת פולשנות מינימלית להדמיה חוזרת בבעלי חיים חיים.
- מספקת מדידות כמותיות וניתנות לשחזור של מחזוריות ומורפולוגיה של קוצים דנדריטיים.
- מאפשרת סטנדרטיזציה של פרוטוקולי הדמיה לצורך השוואה בין מחקרים ובין צוותים שונים.
- מכינה מערכות ביולוגיות חסונות לסריקה פרמקולוגית או גנטית בהמשך.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- עולה בקנה אחד עם מודלים רלוונטיים למחלה של תפקוד סינפטי לקוי ונוירופלסטיות.
- מספק רצף מהשלב של גילוי מולקולרי ועד לתיקוף פרה-קליני של התערבויות במערכת העצבים המרכזית (CNS).
- תומך בהחלטות קידום מותאמות סיכון על ידי קישור פלסטיות מבנית לתוצאים תפקודיים.
- מספק ערך ניבוי לפיתוח ביומרקרים טרנסלציונליים בהפרעות נוירודגנרטיביות ופסיכיאטריות.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
פרוטוקול הדמיה זה משתלב ברצף הגילוי, החל ממחקרים מכניסטיים מוקדמים ועד לתיקוף פרה-קליני, ובכך תומך הן בבחינת השערות והן במדידת תוצאים לאורך זמן.
- ביולוגיית גילוי: מאפשרת בחינה מונחית-היפותזה של פלסטיות סינפטית ועיצוב מחדש של מעגלים in vivo.
- סריקה: מספקת פלטפורמת בדיקה הניתנת לשחזור להערכת השפעות של תרכובות או השפעות גנטיות על דינמיקת קוצים דנדריטיים.
- אנליטיקה: מייצרת נתונים מורפולוגיים כמותיים ורזולוציית-זמן להשוואה סטטיסטית חסונה בין קבוצות ניסוי.
- מחקר תרגומי: מגשרת בין שלבי הגילוי לשלבים הפרה-קליניים על ידי מידול שינויים סינפטיים רלוונטיים למחלה לאורך זמן.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה תהליך עבודה של דימות שניתן להרחבה ולשימוש חוזר, הניתן להתאמה לתוכניות מחקר מגוונות של מערכת העצבים המרכזית (CNS).
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף מטרות במערכת העצבים המרכזית (CNS) ובמחקרים מכניסטיים.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה, השחזוריות והסקילביליות של תהליכי עבודה בדימות in vivo.
- ערך אסטרטגי: תומך בקבלת החלטות מושכלת לגבי המשך או הפסקת פיתוח (go/no-go) ומפחית סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים בתיקי מוצרי CNS.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף של נכסי נוירוביולוגיה מותאם סיכון, בהתבסס על נתונים כמותיים ארוכי טווח (longitudinal).
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בטכניקה כירורגית אספטית ובדימות in vivo מתקדמת.
- דורש גישה למיקרוסקופיה דו-פוטונית ותשתית מדויקת לטיפול בבעלי חיים.
- דורש סטנדרטיזציה קפדנית של פרוטוקולי דימות וניתוח נתונים בין צוותים.
- עשוי לדרוש התאמה עבור זני עכברים שונים או אזורי מערכת העצבים המרכזית (CNS) שונים, בהתאם למיקוד המחקר.
- איכות הדימוי תלויה בדילול קפדני של הגולגולת ובמזעור של פגיעת הרקמות.
