כירורגיה Craniotomy נוהל הדמיה מוחית כרונית

טכניקות דימוג הופכות לחשובות יותר ויותר בחקר תפקודי המוח. ביניהן, מיקרוסקופיית לייזר דו-פוטונית התגלתה כשיטה מועילה ביותר, מכיוון שהיא מאפשרת לחקור את המוח החי עם הכנות מתאימות. טכניקה זו מאפשרת מעקב כרוני אחר אותו אזור קורטיקלי למשך פרקי זמן הנעים מדקות ועד חודשים.

בסרטון זה, אנו מציגים הכנה לדימות כרוני in vivo של המוח באמצעות מיקרוסקופיה פוטונית דו-פוטונית. ד"ר Carl Voda, חוקר ממכון הווארד יוז הרפואי (HHMI) ב-Janelia Farm, היה החלוץ בפיתוח הכנת חלון הגולגולת שנדגים היום. היי, אני Ricardo must מהמעבדה של Carlos Porter Cayo במחלקה לנוירולוגיה באוניברסיטת קליפורניה בלוס אנג'לס.

היום נראה לכם את הפרוצדורה ליצירת חלון גולגולת (cranial window) עבור דימות כרוני in vivo. הכנה זו שימושית מאוד מכיוון שהיא מאפשרת לבצע דימות עמוק בתוך המוח באמצעות מיקרוסקופ לייזר דו-פוטוני. אז בואו נתחיל.

לפני תחילת הניתוח, העכברים מורדמים באמצעות isof fluorine. 4% להשראה, ו-1.5% עד 2% במהלך הניתוח, תוך שימוש בנהלים מאושרים על ידי I-A-C-U-C. חשוב להשתמש בצביטה של הזנב ו/או של בהונות כדי לוודא שהבעל חיים נמצא תחת טשטוש מלא. באמצעות מכשיר גילוח למכרסמים, גוזזים את הפרווה מהחלק האחורי של העורף ועד לעיניים.

לאחר הגילוח, העכבר מונח על מסגרת סטריאוטקסיס, נשען על שמיכה עם סירקולציית מים המכוונת ל-37 °C, והראש מקובע היטב באמצעות מוטות אוזניים. לאחר מכן, נמרח פומדת עיניים כדי למנוע את התייבשות עיני החיה. לאחר מכן, מוגשים באופן תת-עורי dexamethasone במינון 0.2 mg/kg ו-carprofen במינון 5 mg/kg.

זאת על מנת למנוע בצקת מוחית ו/או תגובה דלקתית, בהתאמה. לפני תחילת הניתוח, יש להבטיח את עיקור אזור הניתוח על ידי ניגוב העור באמצעות שלושה סמרטוטים לסירוגין של 70% alcohol ו-Betadine. כל המכשירים הכירורגיים עוקרו מראש באמצעות מכשיר עיקור בחרוזי זכוכית, ובמספריים שהורסו אתן אתנול.

העור מעל קדקו של הגולגולת מוסר, החל בחיתוך אופקי לאורך בסיס הראש, ולאחריו שני חיתוכים בכיוון הרוסטרלי, המגיעים כמעט עד לעפעפיים. לאחר מכן מבוצעים שני חיתוכים אלכסוניים המתכנסים בקו האמצע. בשלב זה, טיפה של תמיסת לידוקאין ואפינפרין נמרחת על הפריאוסטום כדי למנוע דימום מוגבר או כאב; באמצעות סכין מנתחים, הפריאוסטום נדחק לשולי הגולגולת.

גם שרירי העורף נסוגים קלות. לאחר מכן, כל השטח החשוף של הגולגולת נגרד בעדינות בעזרת סקלפל כדי ליצור משטח יבש. פעולה זו חשובה מאוד כיוון שהיא תאפשר לדבק להיצמד טוב יותר בעת יישומו בשלב מאוחר יותר.

לאחר בחירת אתר הדימות, ניתן להכין תחילה את החלון הגולגולתי. מעגל בקוטר של כארבעה מילימטרים מסומן בעדינות באמצעות מקדחה דנטלית פנאומטית. לאחר קידוח קל, מריצים שוב תמיסת lidocaine epinephrine על פני השטח של הגולגולת.

את הקידוח מפסיקים כאשר נותרת שכבה דקה מאוד של עצם, בדרך כלל בעובי של נייר. שלב זה מושג על ידי לחיצה עדינה על מרכז הקרניאוטומיה כדי להרגיש כיצד היא נכנעת תחת טיפת סליין, תוך ניצול של הטרבקות העצם, מבנה ספוגי של העצם.

את פתח הגולגולת (craniotomy) מרימים מהגולגולת בעזרת פינצטה בעלת חוד דק מאוד. השטיפה במי מלח היא חשובה מכיוון שהיא מסייעת בהרמת הגולגולת ומונעת דימום של הקשיחה (dura). לאחר מכן, מניחים על הקשיחה ספוג ג'ל שהושרה מראש במי מלח, וזאת כדי לעצור דימומים קטנים שעלולים להתרחש לעיתים בעת הסרת הגולגולת.

לאחר ייבוש פני הקרומים הקשיחים (dura mater) ווידוא שאין דימום, מניחים בעדינות כיסוי זכוכית סטרילי בעובי חמישה מילימטרים מעל לקרומים הקשיחים. טיפה של דבק המבוסס על ציאנואקרילט נמרחת על ההמיספרה הנגדית של הגולגולת. בעזרת מחט, מורחים בעדינות את הדבק מסביב לחלון, תוך הקפדה לא להניח אותו תחת הזכוכית.

ניתן כעת למרוח שכבה דקה של דבק על פני כל שטח הגולגולת. לאחר ייבוש הדבק, מערבבים אקריליק דנטלי ומורחים אותו על פני הגולגולת, תוך כיסוי של שולי זכוכית הכיסוי כדי לקבע אותה. לאחר קיבוע זכוכית הכיסוי, יוצרים בור קטן מסביב לחלון באמצעות אקריליק דנטלי.

מוט טיטניום מוטמע אף הוא באקריליל דנטלי. מוט זה ישמש מאוחר יותר לקיבוע מאובטח של העכבר על במה של המיקרוסקופ. לצורך ההדמיה, חשוב לוודא שהמוט נמצא במצב מאוזן כך שיהיה מקביל לחלון הגולגולת.

הנחת פיסת נייר מתחת לסבכה יכולה לאפשר לסבכה להישאר מאוזנת בזמן שהאקריליק מתקשה; יש להמתין 10 דקות עד לההשלמה של תהליך הפולימריזציה או ההקשחה של האקריליל הדנטלי, שבמהללם סבכת הטיטניום מקובעת במקומה. לאחר מכן, החיה מועברת לכלוב מחומם עד להתאוששותה. לאחר ההתאוששות מההרדמה, ניתן לבצע דימות של החיה באותו היום.

סרט זה מציג ערימה של 160 תמונות שצולמו במרווחים של חמישה מיקרון באמצעות מיקרוסקופ דו-פוטוני שנבנה על ידינו, דרך חלון קרניאלי שהוצב מעל הקורטקס הסומטוסנסורי של עכבר GFPM בן שלושה חודשים. קו עכברים טרנסגני זה מביע GFP בתת-קבוצה קטנה של נוירונים פירמידליים. בשכבה חמישה ובשכבות שתיים-שלוש, התמונה צולמה עם עדשת שיקוע במים פי 40 בעלת מפתח מספרי של 0.8, תוך שימוש באורך גל עירור של 910 ננומטר.

בתמונות השטחיות יותר, קל לזהות את הענפים הדנדריטיים של הדנדריטים האפיקליים של תאי ה-parametal. הצימה האפיקלית של הדנדריטים של כל נוירון מתכנסת לדנדריט אפיקלי בודד וגדול. ניתן לראות גם דנדריטים אלכסוניים קטנים יותר המסתעפים מדנדריט אפיקלי ראשי זה, ואקסונים החוצים את שדה הראייה ניכרים אף הם.

זוהי ערימה של 12 תמונות שצולמו במרווחים של כל מיקרון וחצי באמצעות אותה עדשה של 40x בהגדלה גבוהה; דנדריט שטחי מוצג ברזולוציה גבוהה מספיק כדי להבחין בעמודי דנדריטים בודדים. הרגע הצגנו בפניכם כיצד לבצע הכנה של חלון גולגולת לדמיון כרוני של המוח באמצעות מיקרוסקופיה פוטונית. זוהי שיטה עוצמתית ביותר למחקר המוח מכיוון שהיא מאפשרת ללמוד הן את המבנה והן את התפקוד של המוח החי, לא רק בדימוי בודד, אלא באופן כרוני לאורך מספר דמיונים בפרקי זמן של חודשים.

יתרון נוסף של הכנת חלון גולגולתי הוא שניתן להדמה שדה ראייה רחב, המאפשר להדמיות של מבנים גדולים, כגון אקסון שלם או עץ דנדריטי, לאורך טווח של מילימטרים. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לעבוד בתנאים הנקיים והסטריליים ביותר האפשריים ולהקפיד על ידיים יציבות מאוד. אוקיי, וזהו זה.

תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.