תגובת תא חי כדי גירוי מכני שנלמדה על ידי מיקרוסקופית כוח משולב אופטי אטומית
4 באוקטובר 2010
מאמר זה נועד להדריך את הקורא בפעולה של כוח אטומי משולב אופטי מיקרוסקופ הדמיה לגירוי מכני של תאים חיים בתרבות. פרוטוקול צעד אחר צעד מוצג. נתונים נציג קבוצה שמראה תא חי בתגובה לגירוי מכני מוצג.
לימוד תגובת תאים בזמן אמת לגירוי מכני מבוצע תחילה על ידי גידול תאים המבטאים חלבוני איחוי GFP על צלחות בעלות תחתית זכוכית למשך 24 שעות. השלב השני הוא ציפוי קצה ה-AFM בפיברונקטין ביוטינילי. לאחר מכן, קצה ה-AFM הפונקציונלי מובא למגע עם פני התא כדי לאפשר היווצרות של הידבקות מוקדית חזקה מסביב לקצה ה-AFM, דבר המאפשר מניפולציה ישירה של שלד התא מבוסס האקטין באמצעות קישור מטריקס-אינטגרין-אקטין בין הקצה המצופה בפיברונקטין לבין התא.
השלב הסופי הוא גירוי מכני של התא החי באמצעות תנועה נשלטת כלפי מעלה של קצה ה-AFM, כך שהכוח האנכי יופעל בנקודת המגע עם התא מבלי לשבור את הדבקות המוקדית (focal adhesion) החזקה. בסופו של דבר, התוצאות מראות כי תאים מגיבים לגירוי המכני על ידי חיזוק היצמדותם למצע ועל ידי השראת ארגון מחדש של שלד התא מאקטין, כפי שתועד באמצעות דימוי אופטי פלואורסצנטי בזמן אמת. שלום, אני אנדריאה טרייק, מרצה בכירה במחלקה לביולוגיה של מערכות ורפואה תרגומית במרכז המדעי לבריאות של Texas A&M.
שלום, אני Sum Lim. אני עמית פוסט-דוקטורט במחלקה לביולוגיה של מערכות ורפואה תרגומית ב-Texas A&M Health Science Center. היום נדגים לכם פרוצדורה לחקר עיצוב מחדש תאי אדפטיבי למעוררות מכנית.
אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדה שלנו כדי לחקור עיצוב מחדש של השלד התאי בזמן אמת בתאי שריר חלק כלי דם חיים. אז בואו נתחיל. למחקרים אלו, נעשה שימוש במיקרוסקופ הפוך Olympus IX 81 עם התקן פלואורסצנציית הח reflection הפנימי total (TIRF) בשילוב עם ראש סריקה CSU 22 Yokogawa.
מיקרוסקופ כוח אטומי מסוג bio scope SZ מורכב מעל מיקרוסקופ אופטי הפוך. המערכת כולה מותקנת על שולחן אופטי ברמה מחקרית ותוארה בעבר בפירוט. מיקרוסקופ משולב זה משתמש בשתי מצלמות quant EM מסוג electron multiplying charge coupled device או E-M-C-C-D.
אחד נועד לדימוי שטח (turf imaging) והשני לדימוי קונפוקאלי. המכלול הקונפוקאלי, המורכב מסורק דיסקה מסתובבת, גלגל מסננים חיצוני ומצלמת E-M-C-C-D, מותקן על פלטת בסיס מאלומינום המונחת על רפידת סיליקון הנחוצה לשיכוך רעידות. המכלול הקונפוקאלי כולו מתחבר למיקרוסקופ באמצעות פלאנג' בעל טבעת הברגה.
כך ניתן להפריד את המכלול מהמיקרוסקופ במהלך מיקרוסקופיית כוח אטומי או מדידות FM כדי למנוע רעידות מהסורק של הדיסקה המסתובבת. לייזר ארגון-קריפטון משמש כמקור עירור הן למצבי דימוי turf והן למצבי דימוי קונפוקליים. ניתן לחבר את הלייזר לאחד משני הסיבים האופטיים, המעבירים את הלייזר לאביזר ה-turf או לראש הסריקה הקונפוקלי.
שני מחשבים שולטים במערכת. אחד משתמש בתוכנת slide book, השולטת בדימות האופטי, והשני בתוכנת nano scope, השולטת ב-AFM. 24 שעות לפני ניסוי הגירוי המכני, העבר תאים חיים המבטאים מבני GFP המכוונים לחלבונים ספציפיים לצלחית תרבית תאים בעלת תחתית זכוכית. ביום הניסוי, החלף את מצע תרבית התאים במצע נטול phenol red.
מכיוון שניסוי a FM רגיש מאוד לרעשים, הימנע מדיבור או ממגע בשולחן האופטי או במיקרוסקופ במהלך הניסוי כדי למזער רעשים. במדידות a FM, נתק את ה-spinning disc confocal מהמיקרוסקופ. הניסוי מתחיל בהנחת צלחת תרבית התאים על במת ה-a FM באמצעות טבעת מגנטית להצמדת הצלחת לבמת המיקרוסקופ המגנטית.
הקנטילבר בצורת V של גשש ה-AFM מותאם אישית עם חרוץ זכוכית ביוטינילי עם קוטר של שני מיקרון. ניתן לראות את הקנטילבר בקלות באמצעות המיקרוסקופ. החרוץ מודבק בקצהו של הקנטילבר, ושם יש להחיל את תמיסת הציפוי בטיפות.
להכנת גשוש FM עבור הניסוי, ראשית התקינו את הראש במחזיק הזכוכית ולאחר מכן הניחו את מחזיק הזכוכית על מעמד השולחן כדי לצפות את הראש. שטפו את הראש על ידי טפטוף זהיר של 10 µL של docos phosphate buffered saline או DPBS בקצה הראש, ולאחר מכן השתמשו בנייר Kimwipe כדי לייבש את הראש. חזרו על הליך זה חמש פעמים לאחר שטיפה עם DPBS בריכוז של 1 mg/mL.
Avid בתמיסה. הוספה בטיפות מעל לקצה. יש להמתין חמש דקות לאינקובציה של הקצה לאחר ציפוי ה-avadon.
שטפו את הקצה חמש פעמים נוספות ב-DPBS. לאחר מכן, בצעו קישור צולב של פיברונקטין ביוטינילי (biotinylated fibronectin) על ה-avadon על ידי הוספה של תמיסה בריכוז של 1 mg/mL. טפטפו את התמיסה על הקצה והדגירה למשך חמש דקות.
לבסוף, שטפו את הקצה שוב חמש פעמים ב-DPBS והשאירו את הטיפה האחרונה על הקצה. לאחר הכנת הקצה, התקינו את הקצה על סורק a FM. לאחר התקנת קצה ה-a FM, הניחו חצאית סיליקון מגינה מסביב למחזיק.
לאחר מכן, הגדירו את המיקרוסקופ לצפייה בווידאו. בשלב הבא, מרכזו את קצה ה-FM במרכז שדה הראייה. הגדירו את המנוף האופטי על ידי מיקום קרן הלייזר בקצהו של הקנטיליוור.
לאחר מכן, החליפו לעדשה בעלת ההגדלה הגבוהה המתאימה לדימוי של תא בודד. לאחר מכן, הביאו לשדה הראייה את התא, אשר יעבור גירוי מכני, ובחרו את המיקום שבו קצה ה-AFM אמור לנחות על פני שטח התא. לבסוף, הורידו את קצה ה-AFM עד שייגע בתא הספציפי.
לאחר הבאת החוד במגע עם התא, המתינו כ-20 דקות. המתנה זו מאפשרת היווצרות של הדבקה מוקדית (focal adhesion) חזקה בנקודת המגע של ה-FM על פני התא. לאחר תקופת ההמתנה, ניתן להתחיל בהליך הגירוי המכני כהכנה לניסוי הגירוי המכני.
עברו ממצלמת הווידאו למצלמת E-M-C-C-D כדי לאפשר צפייה בתאים הפלורסצנטיים לצורך הדמיה. לאחר מכן, רכשו תמונה ראשונית של התא במצב מנוחה. השתמשו במיקרוסקופיה בעלת דיסק מסתובב ובמיקרוסקופיה ווקאלית (vocal microscopy) להדמיות של שלד התא (cytoskeleton) לאורך גוף התא.
לעומת זאת, השתמש ב-turf כדי להדמיא הידבקויות מוקדיות (focal adhesions) לצורך גירוי התא. השתמש בקניסול (cantilever) כדי להפעיל תנועה עולה מבוקרת במדרגות בדידות מדי שלוש עד חמש דקות. במהלך רכישת נתוני ה-A FM, חשוב שהמפעיל ינטר ללא הרף את המתח של מיקום ה-Z piso כדי לקבוע את התזמון הנכון עבור המוט האנכי.
במקביל לרכישת נתוני FM, הקליטו תמונה קונפוקאלית או תמונת Turf של התא לאחר כל מתיחה אנכית באמצעות תוכנת slide book. לבסוף, הוציאו את קצה ה-FM מהתא עם סיום ניסוי הגירוי. תא שריר חלק כלי דם שעבר טרנספקציה עם actin MRFP ו-vcul.
ה-GFP צולם באמצעות FM לפני השטח האפיקלי של התא. אותו תא צולם באמצעות turf לפני השטח הבזאלי של התא. כאן שתי התמונות מוצגות בחפיפה.
תמונה של אותו תא נרכשה גם באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי עם דיסקה מסתובבת (spinning disc confocal) לאורך גוף התא, והיא מוצגת כהשלכה מקסימלית (maximum projection) של ערימה תלת-ממדית. נראית חפיפה טובה בין תמונות ה-A FM ותמונות ה-spinning disc Confocal. תא שריר חלק של כלי דם שטרנספקט עם actin MRFP עבר גרייה מכנית על ידי ה-A FM ודגימה תמונית באמצעות מיקרוסקופיית spinning disc confocal.
השגיאות מעידות על סיבי אקטין המראים ארגון מחדש ניכר בעקבות גירוי FM. חלק מסיבי האקטין פולימריזים בעוד שאחרים דה-פולימריזים כתוצאה מהגירוי המכני, וסיבי אקטין אחרים מתקבצים יחד. בשל ארגון מחדש של האקטין, הרגשנו להראות לכם כיצד לגרות מכנית תרבית תאים חיה באמצעות EFM תוך כדי הקלטה בו-זמנית של סידור מחדש של ה-CY באמצעות שיטות דימיון אופטי.
בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור כי ניסוי FM הוא רועש ורגיש ביותר. זהו כל הפרוצדורה. תודה שצפיתם ובהצלחה עם המדידות שלכם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג פרוטוקול לשימוש במיקרוסקופ דימות אופטי-כוח אטומי משולב להפעלת תאי חיים בתרבית באופן מכני. המתודולוגיה כוללת מדריך שלב-אחרי-שלב ומציגה נתונים מייצגים של תגובות תאי חיים לגירוי מכני.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביולוגיה של התא
- סטימולציה מכנית
- דימוי תאים חיים
רקע
- הבנת התגובה של תאים לגירויים מכניים היא קריטית בביולוגיה של התא.
- מיקרוסקופיית כוח אטומי מאפשרת מניפולציה מדויקת של תאים.
- דימות תאים חיים מספק תובנות בזמן אמת לגבי תהליכים תאיים.
- היצמדות מוקדית (Focal adhesion) ממלאת תפקיד מרכזי בהיצמדות התא ובתגובתו.
מטרת המחקר
- להסביר על תפעולו של מיקרוסקופ ייעודי למחקרי תאים חיים.
- להדגים את ההשפעות של גרייה מכנית על תאים חיים.
- לספק פרוטוקול מפורט המאפשר לחוקרים לשחזר את המחקר.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- תאים המבטאים חלבוני היתוך GFP תורגדו על פיתחי זכוכית.
- קצה ה-AFM מצופה בפיברונקטין מביוטין.
- קצה ה-AFM הפונקציונלי משמש ליצירת הידבקותים מוקדיים עם פני התא.
- גירוי מכני מופעל באמצעות תנועה עולה מבוקרת של קצה ה-AFM.
תוצאים עיקריים
- התאים חיזקו את היצמדותם לתשתיות בעקבות גרייה.
- נצפתה ארגון מחדש של שלד האקטין בתגובה לכוחות מכניים.
- דימות פלואורסצנציה בזמן אמת תפס תגובות תאיות דינמיות.
- הפרוטוקול הדגים בהצלחה את יעילותה של הטכניקה.
מסקנות
- המיקרוסקופ המשולב מאפשר לחקור ביעילות תגובות של תאים חיים לגירויים מכניים.
- שיטה זו יכולה להעמיק את ההבנה של מכניקה תאית והיצמדות (adhesion).
- יישומים עתידיים עשויים לכלול בחינה של סוגי תאים ותנאים שונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הבנה של האופן שבו תאים חיים חשים וכ adaptations למכוחות מכניות היא קריטית להסרת סיכונים מתהליך התיקוף של מטרות במסלולי העברה של אותות מכניים (mechanotransduction). גישה משולבת זו של AFM ודימוי אופטי מאפשרת רזולוציה תת-תאית בזמן אמת של דינמיקת השלד התאי וההיצמדות, ובכך מספקת ביטחון חיזוי בשלבי הגילוי המוקדמים על ידי קישור גירויים מכניים לארגון מבני מחדש. השיטה תומכת בהסרת סיכונים מכניסטית באמצעות ויזואליזציה ישירה של עיצוב מחדש של actin המושרה על ידי כוח וחיזוק של נקודות היצמדות (focal adhesions), ובכך מסייעת בקבלת החלטות של go/no-go בבחירת מטרות טרום-קלינית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן היפותזות טיפוליות על ידי חשיפת האופן שבו גירוי מכני מעורר ארגון מחדש של שלד התא המבוסס על אקטין וחיזוק של היצמדות מוקדית (focal adhesion).
- ערך תפעולי: מאפשר תיקוף תפקודי של מטרות באמצעות תצפית ישירה על דינמיקה של שלד התא התלויה בכוח בתאים נצמדים חיים.
- ערך חיזוי: תומך במיון תיקי פיתוח על ידי קישור קלטים מכניים לתוצרים מבניים, ובכך מפחית עמימות במעורבות של מטרות רגישות למכניקה (mechanosensitive).
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מכין מערכות ביולוגיות שעברו תיקוף עבור זרימות עבודה המשך, על ידי ביסוס פרוטוקולים הניתנים לשחזור עבור גרייה מכנית ודימות בזמן אמת.
- ערך תפעולי: נותן מענה לסטנדרטיזציה של בדיקות ולפלט כמותי באמצעות תנועה מבוקרת של קצה ה-AFM וקריאות פלואורסצנציה מסונכרנות.
- סקביליות: מדגיש את היכולת להשתמש בפלטפורמה עבור סוגים שונים של תאים נצמדים, דבר המאפשר הערכה מהימנה של תרכובות במסגרת קמפיינים של סריקת מכנו-ביולוגיה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: דן ברלוונטיות למחלה על ידי הדגמת צימוד מבני מאפיקאל לבזאלי, שבו גירוי אפיקאלי משרה ארגון מחדש לאורך כל גוף התא.
- קידום מותאם סיכונים: מתאר המשכיות משלב הגילוי ועד לאישור פרה-קליני, באמצעות לכידה של תגובות דינמיות המנחות את התאמת הסמנים הביולוגיים במסלולי מכנו-טרנסדוקציה.
- הפחתת סיכונים מנגנונית: מתמקד בערך של הפחתת סיכונים חזויה על ידי הצגה של האופן שבו הפעלת כוח מובילה לפולימריזציה, דפולימריזציה וצמימה של אקטין, ובכך מבהיר את מנגנון הפעולה.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
שיטה זו משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת השערות ועד לזיהוי מובילים (leads), ובכך היא מספקת תובנות מכניסטיות לפני סריקת תרכובות.
- ביולוגיה של תגליות: מסביר כיצד השיטה תומכת בבדיקת השערות באמצעות יישום של גירוי מכני מבוקר ותצפית בזמן אמת על עיצוב מחדש של השלד התאי.
- סריקה: מתאר את מוכנות הבדיקה באמצעות יצירה הדירה של הידבקות מוקדית (focal adhesion) ודימות כמותי של דינמיקת actin באמצעות שיטות TIRF ומיקרוסקופיה קונפוקאלית.
- אנליטיקה: מדגיש מדידות כגון אירועי פולימריזציה/דפולימריזציה של actin ושינויים בעוצמת ההידבקות המוקדית, המאפשרים השוואה בין מצבים מעוררים למצבי מנוחה.
- מחקר תרגומי: מקשר את השיטה לרצף פרה-קליני על ידי הדגמה של האופן שבו גירוי מכני אפקלי מפיץ שינויים מבניים דרך גוף התא, דבר הרלוונטי להעברת כוחות ברמת הרקמה.
- שימוש חוזר ארגוני: מציג את השיטה כיכולת הדירה למחקר של מטרות רגישות למכניקה (mechanosensitive) במודלים של תאי כלי דם, תאי אפיתל ותאי מזנכימליים.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: ביטחון חיזוי בתיקוף מטרה, הפחתת עמימות מכניסטית במסלולי העברה מכנית (mechanotransduction).
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה, שחזוריות ויכולת הרחבה של גירוי מכני ודימוי רב-מודאלי.
- ערך אסטרטגי: קבלת החלטות משופרת לגבי המשך או הפסקה (go/no-go), יעילות הון והפחתת סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים בתוכניות של מכנוביולוגיה.
- השפעה על הפורטפוליו: תיעדוף והחלטות קידום מותאמות סיכון, המבוססות על תצפית ישירה של הסתגלות תאית המושרה על ידי כוח.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות מדעית בהפעלת AFM, דימוי תאים חיים ודינמיקה של השלד התאי.
- הצרכים הציודיים כוללים מערכת משולבת של AFM-TIRF-confocal עם שיכוך רעידות ומצלמות EM-CCD כפולות.
- סטנדרטיזציה בין צוותים מחייבת הקפדה על פרוטוקול עבור פונקציונליזציה של הקצה, יצירת הדבקות מוקדיות (focal adhesion) ותזמון הגירוי.
- שיקולי התאמה כוללים קשיחות מצע משתנה, חלבוני ציפוי וסוגי תאים שונים, תוך שמירה על ספציפיות של גירוי אפקלי.
- מגבלות מעשיות כוללות רגישות לרעש במהלך מדידות AFM והצורך בתנאים סביבתיים מבוקרים לצמצום הסחף (drift).
