ליד סריקת לייזר בו זמנית מיקרוסקופיה קונפוקל וכוח אטומי (Conpokal) על תאים חיים

Conpokal משלב מיקרוסקופיה קונפוקאלית עם מיקרוסקופ כוח אטומי באמצעות בדיקה כדי לתקוע את פני השטח מדגם. למרות ששתי הטכניקות יעילות בנפרד, קונפוקל מקל על לוקליזציה פלואורסצנטית עם אפיון מכני. היתרון העיקרי של טכניקת קונפוקל, הוא מיקרוסקופיה כפולה כמעט בו זמנית.

Confocal חוקר cytoskeletal ותהליכים תאיים אחרים לפני ואחרי AFM, אשר מספק תכונות מכניות ספציפיות לאזור. טכניקה זו היא השפעה בתוך השדה mechanobiology כמו למשל, תאי המוח ניתן לחקור בתנאים פיזיולוגיים כדי לבחון דחפים חשמליים עסקת כוח. לפני תחילת הניתוח, בחר CANTILEVER AFM מתאים עבור איסוף הנתונים הרצוי ולהשתמש כפפות, שלב הרכבה שבב AFM, פינצטה, מברג קטן כדי לטעון את השבב לתוך בלוק הזכוכית.

מניחים בזהירות את שבב AFM על מרכז בלוק הזכוכית. Cantilever בתוספת חלק קטן מאוד של שבב AFM צריך להיות בחלק גלוי, לא אטום של בלוק הזכוכית. השתמש במברג כדי להדק את הבורג עד השבב נוח נגד בלוק הזכוכית, ולהשתמש בעדשה כדי לבדוק כי השבב מכוון כראוי.

כאשר השבב היה מכוון כראוי, למקם את בלוק הזכוכית לתוך ראש AFM בכיוון הנכון ולנעול את בלוק הזכוכית למקומו. לאחר איתור החלק התחתון של צלחת הכיול על ידי מיקרוסקופיה שדה בהיר, להשתמש במערכת AFM מערכת Z צעד מנוע בקרה הלוח כדי להזיז את CANTILEVER AFM 2000 מיקרון מעל המדגם. באמצעות תאורת שדה בהירה ואת לוח הבקרה של מנוע צעד Z, לאט להוריד את שבב AFM לתחתית צלחת הזכוכית בשלבים של 100 עד 200 מיקרון, כדי למנוע קריסה של קצה AFM לתוך צלחת פטרי.

אתר את המיקרומטרים הידניים השליטה ב- X Y או בתנועה רגילה של ראש AFM בפלטפורמת המכשיר. ככל שהצל מה- AFM הופך כהה יותר, והצורה הופכת חדה יותר, השתמש במיקרומטרים הידניים כדי לתקן את ראש ה- AFM ולהתאים את מיקום ה- AFM בתוך שדה המבט. בשלב זה, ייתכן שיהיה צורך להתאים את טבלאות בדיקת המידע.

צפה עבור צל להופיע בתצוגת תוכנת מיקרוסקופ, אשר מציין כי קצה AFM מתקרב לתחתית המנה. המשך להשתמש בשלבים קטנים כדי להוריד את קצה ה- AFM עד שהטיפ יהיה בעיקר בפוקוס. כאשר הלייזר נמצא בעמדה, השתמש בחוגות יישור הלייזר כדי למקם את הלייזר בצד האחורי של המקום שבו קצה AFM ממוקם על cantilever.

לוח יישור הלייזר אמור להציג אות סכום גדול מאפס וולט. להזיז את הלייזר, מרחק קטן בכל הכיוונים על cantilever AFM, עד אות הסכום המרבי מושגת תוך שמירה על קצה AFM. לאחר הגדרת מיקום הלייזר, השתמש בחוגות ההטיה הנשלטות באופן ידני לאפס את ההטיה האנכית והמאוחרת.

השתמשו ב ידיות ההטיה האנכיות והצלביות כדי ליישר את הגלאי כך שהמטרה תהיה מרוכזת ולא נצפתה הסטה אנכית או או רבתית בלוח יישור הלייזר. פתח את חלון הכיול והזן את כל המידע הספציפי של הניסויים. החלף את מסנן אור הלייזר.

לפני הכיול, כבה את מקור האור של המיקרוסקופ הקונפוקלי וסגור את מארז AFM כדי לעמעם כל רעש פוטנציאלי המגיע מהאור או התנודות בחדר. לחץ על לחצן כיול כדי לאפשר למערכת לכייל את הקצה באופן אוטומטי. לאחר השלמת הכיול, הנוקשות של ה- cantilever והרגישות שלו יוצגו בלוח הכיול.

לאחר מכן השתמשו בלחצן 'פקודת גישה אוטומטית' כדי להנמיך את הקצה לתחתית צלחת הדגימה ולהגדיר את גודל אזור העור, הרזולוציה, נקודת הסט, אורך Z וזמן הפיקסל, לפני שתלחץ על לחצן ההפעלה כדי להתחיל בסריקה. להדמיית מיקרוסקופ קונפוקל בתוכנת המיקרוסקופ, אפשר את יכולות הקונפוקל ובחר את קווי הלייזר המתאימים לצבעים ששימשו להכתמת הדגימות. בחר קו לייזר אחד או יותר כדי לרגש ולדמיין תכונות אלה בדגימה והגדר את הרווח לערך הממטב את הפלואורסצנטיות לדוגמה אך מגביל את כמות הרעש.

כוונן את עוצמת הלייזר כדי להימנע מפיקסלים רוויים תוך מקסום הטווח הדינמי והגדר את גודל חור הסיכה ליחידת שטח אחת כדי למקסם את הרזולוציה עבור החיתוך האופטי. במידת הצורך, התאימו את הערכים בהתאם לבהירות הדגימה. כדי לקבוע את זמן ההתעכבות של הפיקסלים, התחל עם זמן שהות של כשני מיקרו-שניות והתכוונן כדי לשקף את בהירות הדגימה לפי הצורך.

לבחירת גודל הפיקסל עבור המטרה שנבחרה, אפשר לכלי לחשב את גודל הפיקסל באמצעות לחצן האפשרויות Nyquist ומספר הפיקסלים שנבחר בתמונה. לאחר מכן, בחר באפשרות סריקה והתחל את איסוף הנתונים. השתמש בלחצן המוקד כדי לאתר את מישור המוקד המייצג את תכונות הדגימות בצורתו הברורה ביותר, את לחצן סריקה כדי להתחיל באיסוף נתונים ואת לחצן לכידה כדי ללכוד תמונה דו-ממדית.

באמצעות החלונית השולטת בגודל הפיקסל באמצעות האפשרות Nyquist, הקטן את גודל השטח של הסריקה כדי לתחום תא אחד בלבד. הפעל את כלי האיסוף ושימוש באפשרות מלמטה למעלה, כאשר רק קו הלייזר המאיר תכונה בדגימה בצורה ברורה ביותר, הגדר את מישורי ההתחלה והסיום כדי שהנפח יימדד באמצעות המרווח המוצע בין המישורים. תן שם לקובץ ושמור אותו בתיקיה המשויכת.

לחלופין, אם הידע שלנו מראש של עובי הדגימות קיים, בחר את המישור הבהיר, החד ביותר, האמצעי על ידי התאמת המוקד כדי להגדיר את עוצמת הקול ולהגדיר את החלק העליון כדי לקבל את עובי המדגם מעל המישור האמצעי, ואת החלק התחתון יש את העובי מתחת למישור האמצעי, ולאחר מכן בחר את גודל הצעד המתאים. הפעל את הרכישה על-ידי לחיצה על לחצן הפעל כעת. כאשר הרכישה מסתיימת, שמור את הקובץ בתיקיה המתאימה.

בסוף הניסוי, ללבוש כפפות תוך הסרת בלוק הזכוכית למקם אותו לתוך תחנת ההרכבה. השתמש פינצטה עם ידיות גומי כדי להסיר בזהירות את שבב AFM ולמקם את הקצה בשימוש בחזרה לתוך המיקום של תיבת האחסון בכיוון את הגישה כדי לציין כי זה היה בשימוש. לעיון בעתיד, שים לב באיזה טיפ נעשה שימוש בניסוי.

כאן, סריקת AFM נציג מעל תא HEK חי מוצג. הגובה של תא HEK המסוים הזה היה סביב 10 מיקרון כפי שהודגם על ידי סריקת הקו. כאן, דוגמה של סריקה גרועה בשל בחירת קצה AFM לא תקין ניתן לראות.

בתמונה זו, פיקסלים שחורים הופיעו בשיא התא והצביעו על כך שאזור AFM PA היה מחוץ לטווח עקב גובה תא גדול. סוף ה- AFM cantilever מופיע גם בתמונה עקב היסט הקצה בשילוב עם גובה קצה לא מספיק בהשוואה לגובה התא. ממצאים אלה בתדמית AFM מציינים שהיה צריך לבחור קצה AFM אחר כדי להציג את התא בתמונה.

ניתן לבצע דימות קונפוקל בשלושה צבעים. לדוגמה, כדי לדמיין את גרעין התא, צינוריות מיקרו, קרום ליפופילי. ניתוח חריצים קצה בשילוב עם המודל מכני ננו, מאפשר את הדור של מפת מודולוס של פני השטח.

כאן, הקרנה תלת-מימדית תואמת של מחסנית ה- Z הקונפוקל לייזר מוצגת. סריקות AFM ומפות מודולוס נמדדות ניתן לרכוש גם עבור חיידקים, כפי שנצפה בניתוח מייצג אלה של חיידק סטרפטוקוקוס מוטנס. כפי שהוכח, רזולוציה טובה יותר ניתן להשיג בקנה מידה זה עם AFM, מאשר עם מיקרוסקופ קונפוקל מסורתי.

מיפוי כוח דבק הוא טכניקה המבוצעת באמצעות קונפוקל כדי לדמיין אינטראקציות מולקולריות. לדוגמה, כדי ללמוד את אפנון של מולקולות פני השטח של התא כדי לבחון קינטיקה מחייבת. Conpokal סדרנים במסלול חדש לחקר יחסי תפקוד מבנה במיקרוביולוגיה רפואית.

לדוגמה, אירועים פיזיים וכימיים ואת השכבה peptidoglycan, יכול להיות קשור עמידות לאנטיביוטיקה.