Pseudofracture: טראומה חריפה היקפיים דגם רקמות
18 באפריל 2011
Pseudofracture, מודל Murine לשחזור הטראומה שרירים ושלד סטרילי, מאפשרת הערכה של המנוח פוסט טראומטית התגובות טווח החיסונית. מאמר זה מתאר את נוהלי ביצוע של צעד אחר צעד את המודל, כולל פוטנציאל שילובים מודל ניסיוני כדי לאפשר לימוד של טראומה מרובים.
כאשר עצם ארוכה, כגון פמור (עצם הירך) או טיביה (שוק), נשברת, השריר והרקמות הרכות הפגועים נחשפים לרסיסי עצם פגועים ולמחית עצם. לאחר מכן מתרחשת תגובה חיסונית חזקה כדי לסייע בתיקון הרקמה. ניתן ליצור מודל לחקר השפעות חשיפה זו על ידי קציר של שתי עצמות הפמור והטיביה.
מעכבר תורם. העצמות נמעכות כדי ליצור תמיסת עצם, המוזרקת לאחר מכן לירך הפגועה של עכבר מקבל. לאחר מכן מנטרים את התגובות החיסוניות ומעריכים פגיעות באיברים מרוחקים כדי לחקור את ההשפעות ארוכות הטווח של טראומה שנגרמה כתוצאה משבר.
היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות של טראומה ברקולת היקפית, כגון מודל שבר דו-צדדי בירך, הוא שמודל זה, מודל השבר המדומה (pseudo fracture model), מאפשר הישרדות לטווח ארוך ללא סיבוכים של הרדמה ממושכת או טכניקות מורכבות של קיבוע שברים, ובכך הוא מאפשר את חקר התגובות החיסוניות בטווח המאוחר שלאחר הטראומה. לפני תחילת הפרוצדורה, הכינו את הציוד הבא: דלי קרח, Betadine, מכשירים כירורגיים, פליירים להומיסטזיס (hemostats), מכתש ועלי, פינצטה, מחטים בכילוי 20 gauge, מזרק של 1 CC, PBS, חומרי הרדמה ומסכה לאף להזרקת isof fluorine. עכבר בודד שהורד, תואם בגיל ובמשקל.
עכבר תורם גני צריך לספק מספיק חומר עבור שלושה מקבלים. הצמידו את התורם ללוח פלקסיגלס באמצעות סרט דביק, תוך הקפדה להדביק את הגפיים התחתונות רק בקצות הרגליים. גלחו בזהירות את הגפיים התחתונות.
לאחר מכן, כסו אותם לחלוטין ב-Betadine ובאלכוהול לצורך סטריליזציה, כדי להוציא את העצמות הארוכות מהגפה התחתונה. בצעו חתך כירורגי בעור באזור המפשעה (inguinal region), והמשיכו לחתוך את העור לאורך הגפה עד לקרסול. הסיטו את העור והפרידו אותו מהפציה תת-עורית ומהשריר, הן בצד המדיאלי והן בצד הלטרלי. לאחר מכן, הכניסו להב אחד של המספריים תחת השרירים הממוקמים קדמית ולטרלית לטיביה. החליקו את הלהב פרוקסימלית ודיסטלית כדי להרים את השרירים בצורה נקייה מהעצם שמתחתיהם.
חזור על טכניקה זו בחלק האחורי והמדיאלי של הצד התחתון של הטיביה (tibia) כדי להפריד את השרירים שמתחת לטיביה. יש להפעיל מאמץ נוסף מינימלי בצד האחורי בעת ההחלקה דיסטלית, כדי לנתק את הפיבולה (fibula) מהטיביה בקצה הפרוקסימלי של שרירי הרגל הללו. גזרו את הגידים קרוב ככל האפשר לאתרי ההחדרה שלהם, והסיטו את השרירים דיסטלית תוך כדי משיכה של קבוצת השרירים יחד כלפי מטה; משיכה קלה תשחרר את ההיצמדות הדיסטלית ממפרק הקרסול. השתמשו במספריים כדי לחתוך דרך מפרק הקרסול.
אין להפריד את השוק (tibia) מהירח (femur) בשלב זה, שכן חיבור זה מספק מנוף נוסף שיסייע בהפרדת הירח ממפרק הירך. השתמשו בטכניקה דומה לשחרור השרירים מהירח. בצעו זאת בחלק האחורי ובמידת הצורך גם במדיאלית ובלטרלית.
גזרו את החיבור הדיסטלי של קבוצות שרירים אלו כדי לשחרר אותן ממפרק הברך. הרחיבו את חתך העור לפי הצורך כדי להשיג חשיפה מספקת ועקבו תחת השרירים. כדי להוציא את קצה הפמור ממפרק הירך, הסירו את הפמור ואת הטיביה המחוברת מהעכבר התורם והניחו אותם על גזה סטרילית.
הפרידו את שתי העצמות במפרק הברך על ידי תפיסת כל עצם ביד נפרדת וסיבוב או רטט עדין של שתי העצמות בכיוונים מנוגדים לאורך הצירים הארוכים שלהן. כדי להסיר את שאריות התסמיכים המחוברים לעצמות הארוכות, עטפו פיסת גזה בגודל 4x4 סנטימטרים לאורך העצם. אחזו בחוזקה וגרדו את מלוא אורך העצמות מספר פעמים כדי להסיר את הרקמות הנותרות מהשטח.
העבירו את העצמות שנאספו אל מיקרו-צנור סטרילי בנפח 1.5 milliliter על קרח. העבירו את עצמות התורם אל קבינת בטיחות ביולוגית שחוּטרה היטב. להכנת תמיסת העצם.
יש להכין במכס הפס (hood) תחבושת סטרילית לשדה, מכתש ועקת סטריליים, פינצטה סטרילית, מבחנה סטרילית של שמונה מיליליטר, פלטה סטרילית של PBSA, פיפטה של מיליליטר אחד עם טיפים מתאימים, פיפטמן של 100 מיקרוליטר עם טיפים מתאימים, מזרקים של מיליליטר אחד ומחטים במידה 20. בעזרת הפינצטה, העבירו את העצמות למכתש והשתמשו בעקת כדי למעוך את העצמות בעדינות. פפיט liter מיליליטר אחד של PBS לתוך המכתש והמשיכו למעוך את השאריות בתנועות סיבוביות כדי להבטיח סספנציה מלאה.
לאחר מכן, הוסיפו מיליליטר נוסף של PBS והמשיכו למעוך כדי ליצור את תמיסת העצם, שצריכה להיות בעלת גוון ורוד. שפכו באיטיות את התמיסה מהמכתש אל תוך המבחנה בנפח שמונה מיליליטר, תוך הבטחה שכל השאריות הגדולות יישארו מאחור. העבירו את תמיסת העצם למזרק של מיליליטר אחד.
בעזרת מחט מדד 20, יש להשאיר את תמיסת העצם על קרח. יש להטיל פיפטה של מיקרוליטר אחד מהתמיסת העצם על צלחת MacConkey ולפרוס אותה באופן אחיד על פני השטח. יש להדגיר את הצלחת למשך 24 עד 48 שעות כדי לוודא סטריליות.
התחילו את ההליך הניתוחי להזרקת תמיסת עצם ופגיעה ברקמה רכה על ידי הערכת עומק ההרדמה של עכבר שהורדם ב-penta barbital באמצעות צביטה של בהונות. הניחו את העכבר במצב שכיבה (supine) על לוח פלקסיגלאס וקבעו את בעל החיים על ידי ה wrapping רופף של רצועות דבק דקות, כאשר הצד הדביק פונה החוצה, סביב החלק הדיסטלי של כל גפה. השתמשו במכונת גילוח עם להב גודל 40 כדי לגלח את אזורי הבטן, המפשעה והירך של בעל החיים.
העבירו את העכבר לשדה הניתוח הסטרילי. נגבו את אזור הניתוח עם Betadine. לאחר מכן, נגבו עם אלכוהול כדי לעקרו.
הניחו על אפו של העכבר חרוט אף המכיל פיסת גזה עם מיליליטר אחד של 99% isof fluorine. ברגע שנשימתו של בעל החיים תתחיל להאט, הסירו את חרוט האף. אם יידרש הרדמה נוספת במהלך כל שלב בפרוצדורה, ניתן להזריק פנטוברביטול נוסף או להעניק isof fluorine.
לאחר מכן, קפלו תחבושת שטח סטרילית ופרסו אותה על העכבר כך שרק הגפיים התחתונות והראש יישארו חשופים. פגיעה זו ברקמה הרכה היא פגיעת מעיכה דו-צדדית של הגפיים האחוריות. ודאו שהעכבר ממוקם כך שהגפיים האחוריות נמצאות באבדוקציה (הרחקה) קלה וברוטציה (סיבוב) לטרלית.
פעולה זו מסייעת בגישה לשריר הנכון. קבצו את מכופפי הברך כדי לבצע את פגיעת המעיכה. הצמידו תפס המוסטטי גדול של 18 סנטימטר סביב נקודת האמצע של שרירי הרכיה האחוריים לאורך הפמור, כאשר העקמומיות הקמורה פונה לעבר הפמור. נעלו את ההמוסטט בלחיצה ראשונה בלבד למשך 30 שניות.
החדירו את המחט דרך העור למשך שני עד שלושה מילימטרים, עד שקצה המחט נוגע בעצם הירך. הזריקו 0.15 milliliter של תמיסת העצם לתוך שרירי הירך המעוכים בכל צד. הוציאו את המחט והניחו במהירות אצבע עם כפפה סטרילית מעל אתר ההזרקה כדי למנוע זרימה חוזרת של תמיסת העצם אל מחוץ לפצע.
החזיקו את האצבע במקום זה למשך מספר שניות. החזירו את העכבר לכלוב ואפשרו לו חופש תנועה מלא מיד עם פגיית ההשפעה של ההרדמה. יש להעניק טיפול תואם לניהול כאב בעת התעוררות העכבר.
סכימה כללית זו מציגה את התגובה החיסונית הדו-פאזית בעקבות טראומה בנקודת הזמן של שעת אפס. הטראומה נגרמת. לאחר מכן חלה תגובה דלקתית היפר-אקטיבית מוקדמת, שניתן לראות כי היא מגיעה לשיאה לאחר שש שעות, והיא נמדדת באמצעות הערכה של דלקת סיסטמית ודיספונקציה של איברים מרוחקים.
המרכיב השני של התגובה החיסונית לאחר הטראומה הוא דיכוי חיסוני מאוחר הנמדד באמצעות תפקוד לקוי של תאי מערכת החיסון, והוא מופיע כשקיעה סביב 48 שעות. זוהי תרשים מייצג של תגובת ציטוקינים דלקתיים בפלזמה המתרחשת זמן קצר לאחר הטראומה, ומהווה דוגמה לדלקת מערכתית. נמצא כי תפקוד לקוי של איברים מרוחקים, כפי שנמדד באמצעות פגיעה בכבד, מוגבר בפרק זמן דומה.
דיאגרמה מייצגת זו משמשת כדוגמה להדגשת תפקוד לקוי של תאי מערכת החיסון בשלב מאוחר לאחר טראומה. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להבטיח סטריליות ומניפולציה מדויקת לאורך כל הניסוי. אין לראות בכך מודל של שבר אמיתי או של זיהום פצע.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג מודל עכברי של טראומה שלד-שרירית סטרילית המכונה פסאודו-שבר (pseudofracture), המאפשר הערכה של תגובות חיסוניות מאוחרות לאחר טראומה. ביצוע הפרוצדורה של מודל זה מתואר בפירוט, תוך הדגשת הפוטנציאל לשילובי ניסויים לבחינת טראומות מרובות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- אימונולוגיה
- מחקר טראומה
רקע
- פסאודו-שבר (Pseudofracture) הוא מודל המדמה טראומה של השלד והשרירים.
- הוא מאפשר לחקור תגובות חיסוניות בעקבות פגיעה.
- הבנת תגובות אלו היא קריטית לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות.
- ניתן לשלב את המודל עם מערכים ניסיוניים אחרים לצורך מחקרים מקיפים.
מטרת המחקר
- להערכת תגובות חיסוניות לאחר טראומה של השלד והשרירים.
- לספק מודל הניתן לשחזור למחקרים עתידיים.
- לבחון את ההשפעות של טראומה משולבת על תגובות חיסוניות.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- קציר עצמות פמור (femurs) וטיביה (tibiae) מעכברי תורם.
- ריסוק העצמות ליצירת תמיסס עצם.
- הזרקת התמיסס לירך הפגועה של עכברי מקבל.
- ניטור תגובות חיסוניות והערכת פגיעות באיברים מרוחקים.
תוצאות עיקריות
- הפגין תגובה חיסונית חזקה לפגיעה בעצם.
- זיהה השפעות ארוכות טווח של טראומה שנגרמה משבר.
- הראה פוטנציאל למחקר של תרחישי טראומה מרובים.
- סיפק תובנות לגבי מנגנוני תיקון רקמה.
מסקנות
- פסאודו-שבר (Pseudofracture) הוא מודל בעל ערך לחקר תגובות חיסוניות פוסט-טראומטיות.
- ניתן להשתמש בו בשילובים ניסיוניים שונים לשיפור המחקר.
- מחקרים נוספים עשויים להוביל לגישות טיפוליות משופרות לטראומה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מודל הפסאודו-שבר בעכברים מאפשר חקירה הדירה של תגובות חיסוניות בשלב החריף ובשלב המאוחר לטראומה סטרילית של רקמה פריפריאלית, ובכך נותן מענה לפער קריטי במחקר טראומה תרגומי. תכנונו עוקף את המגבלות הטכניות ומגבלות ההישרדות של מודלי שברים מסורתיים, ותומך במחקרים מכניסטיים ארוכי טווח הרלוונטיים להפחתת סיכונים אימונולוגיים ותיקוף מטרות. מודל זה נועד לסייע בגילוי מוקדם ובהערכה פרה-קלינית של אסטרטגיות אימונומודולטוריות בפורטפוליו של טראומה ושיקום רקמות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה של מסלולי חיסון המושרים על ידי טראומה באמצעות זני עכברים מוגדרים גנטית.
- תומך בהפחתת סיכונים מכניסטית על ידי מידול של שלבים היפר-דלקתיים ומדכאי-חיסון לאחר טראומה.
- מקל על תיקוף תפקודי של מטרות עבור מודולטורים חיסוניים במערכת מבוקרת וניתנת לשחזור.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- מספקת פלטפורמה סטנדרטית וניתנת להרחבה להערכת ביומרקרים של פגיעה אימונולוגית ואיברים לאחר טראומה רקמתית.
- מאפשרת מדידה כמותית הדירה של דלקת סיסטמית ושיבוש תפקוד של איברים מרוחקים.
- תומכת בפיתוח בדיקות לאפיון ציטוקינים ולשיבוש תפקוד של תאי מערכת החיסון בשלב מאוחר.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתואם עם מודלים של טראומה הרלוונטיים למחלה לצורך תיקוף פרה-קליני של מועמדים לאימונותרפיה.
- מאפשר מחקרים אורכיים של תגובה חיסונית ופגיעה באיברים, ובכך תומך בגילוי של ביומארקרים תרגומיים.
- מסייע בקבלת החלטות על קידום מותאם-סיכונים באמצעות מידול של סיבוכי טראומה רלוונטיים מבחינה קלינית.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
מודל זה מגשר בין שלבי הגילוי המוקדמים למחקר הפרה-קליני, בכך שהוא מאפשר בדיקה מונחית-השערה של תגובות חיסוניות לטראומה ותומך בתיקוף של סמנים ביולוגיים וטיפולים בהמשך התהליך.
- ביולוגיה של הגילוי: תומכת בבדיקת השערת האפס של מנגנונים חיסוניים ומעורבות של מסלולים המושרים על ידי טראומה.
- סריקה: מספקת קריאות כמותיות הניתנות לשחזור עבור נקודות קצה של פגיעה חיסונית ואיברית.
- אנליטיקה: מאפשרת השוואה סטטיסטית של תגובות חיסוניות בין תנאים ניסיוניים ונקודות זמן שונות.
- מחקר תרגומי: ממדלת תפקוד חיסוני לקוי ופגיעה באיברים בעלי רלוונטיות קלינית לצורך התאמה של סמנים ביולוגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פלטפורמת טראומה סטנדרטית וניתנת לשימוש חוזר, הניתנת להתאמה לרקעים גנטיים ושילובי ניסויים שונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף מטרות חיסוניות ובצמצום סיכונים מכניסטיים.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות והיכולת להרחבה (scalability) של מחקרי טראומה ארוכי טווח.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות לגבי המשך או הפסקת (go/no-go) תוכניות של אימונו-מודולציה המכוונות לסיבוכי טראומה.
- השפעה על תיק הנכסים: תומך בתעדוף מותאם סיכונים של נכסי טראומה ואימונולוגיה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטכניקות כירורגיות בעכברים ובבדיקות אימונולוגיות.
- נדרשת גישה לתשתיות כירורגיות ואנליטיות סטריליות לצורך ניתוח רקמות ובדיקת סמנים ביולוגיים.
- דורש סטנדרטיזציה קפדנית בין צוותים כדי להבטיח הדירות והשוואתיות של הנתונים.
- ניתן להתאמה לזני עכברים שונים, כולל קווי טרנסגניים ו-knockout, לצורך מחקרים ספציפיים של מסלולים ביולוגיים.
- אינו מהווה מודל לזיהום או לשבר אמיתי, מה שמגביל את היישום הישיר לנקודות סיום זיהומיות או אורתופדיות.
