הגנום כולו ניתוח באמצעות שבב זיהוי איזופורם ספציפי מטרות ג'ין

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לזהות מטרות גנומיות של KDM5A, הידוע גם כ-RBB2, היסטון דמתילאז. מטרה זו מושגת על ידי הכנת כרומטין מקשיר (cross-linked chromatin) שעובר סוניקציה בשלב השני כדי להפיק מקטעי DNA בגודל המתאים. מקטעי DNA הקשורים ל-RBB2 מופקים באמצעות שיקוע חיסוני (immunoprecipitation) עם נוגדנים ל-RBB2.

בשלב הבא, ה-DNA הגנומי שהופק מועשר באמצעות PCR לצורך ריצוף. לבסוף, קריאות קצרות שרוצפו בשיטת Illumina מיושרות באופן ייחודי לגנום האנושי, ופסגות משמעותיות מזוהות ומאושרות לגנים הקרובים ביותר. על מנת לזהות rbbb two target genes, מתקבלים תוצאות המראות תפקודים מולקולריים הקשורים ל-Rrb B two target genes על בסיס זיהוי גנומי של אזורים מועשרים של Rbbb two.

שלום, אני מייק. אני מהמעבדה של ד"ר Elizabeth Bencia במחלקה לביוכימיה וגנטיקה מולקולרית באוניברסיטת אילינוי בשיקגו. ואני אלה מהמעבדה לגנומיקה ביו-רפואית בהובלת ד"ר NGA בפארק המחקר הביו-רפואי BARCEL באוניברסיטת PO P fea.

ואני דניאל דאל. ואני ויליאם ריכטר. שנינו נמצאים גם במעבדה למיומנויות ב-Benevolence.

היום נדגים לכם פרוצדורה של שיקוע חיסוני של כרומטין (chromatin immunoprecipitation) וריצוף. אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדה שלנו כדי לחקור את אתר הקישור של his dermatologist. בואו נתחיל.

כדי להתחיל בהליך זה, גדלו כ-10⁸ תאים עבור כל immunoprecipitation או ip. במקרה זה, לימפומה אוסטאוליטית דיפוזית.

תאי U 9 37 משמשים ומושרים לדיפרנציאציה מונוציטית באמצעות TPA למשך 96 שעות לאחר צמיחת התאים; הוסף תמיסת פורמאלדהיד ישירות למצע עד לריכוז סופי של 1%. לאחר מכן, סובב את הבקבוק קצרות והמתן 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שאב את המצע ושטוף את התאים עם 15 milliliters של PBS קר מאוד. חזור על שטיפה זו פעם אחת נוספת.

בשלב הבא, הוסיפו ששה מיליליטר של lysis buffer one לכל אחד מהבקבוקים על קרח. לאחר מכן, נערה את הבקבוקים בתנועת נדנוד למשך 20 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לבסוף, אספו את התאים באמצעות גורד תאים (cell scrapper) והעבירו אותם למבחנות קוניות של 15 מיליליטר.

בשלב זה, ניתן לאחסן את התאים בטמפרטורה של 80- °C. אם התאים היו קפואים, יש להפשיר אותם. לאחר ההפשרה, יש לסובב את התאים בצנטריפוגה ולהיפטר מהנוזל העליון.

לאחר מכן, השביה מחדש את התאים ב-six milliliters של lysis buffer two, וטלטל את המבחנות בעדינות בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. חזור על הסבב של הצנטריפוגציה והשביה מחדש את התאים ב-2.5 milliliters של lysis buffer three. לאחר מכן, הכן את התמיסה לסוניקציה על ידי הנחתה בכלי זכוכית עם מי קרח, תוך שימוש בראש מיקרו של Branson 450 sonier המכוון לאמפליטודה של בין 50% ל-60%.

בצע סוניקציה לתמיסה בפולס קבוע של 32 שניות וקרר על קרח. חזור על פולסים אלו 10 עד 15 פעמים במשך דקה אחת, לאחר מכן העבר את תכולת המבחנה מעלה ומטה באמצעות פיפטה והעבר אותה למבחנה חדשה. המשך לבצע פולסים וקירור לתמיסה.

חמישה פעמים נוספות לאחר הסוניקציה, הוסיפו 10% Triton X 100 לכמות השווה לעשירית מנפח התמיסה. לאחר מכן, העבירו את הליזטים למבחנות צנטריפוגה של 1.5 milliliter, והסדירו את השאריות באמצעות צנטריפוגה מיקרוסקופית לפני ביצוע chromatin immunoprecipitation או chip. שמרו 50 microliters מהליזט התאי כדגימת input.

לאחר מכן, שילבנו את ליזט התאים המסונן עם dyna beads הקשורים לנוגדן, שהוכנו מראש כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. ערבבנו את התערובת, בתוספת דגימת קלט של 50 µL, על נדנדה בטמפרטורה של 4 °C למשך הלילה. שטפנו את החרוזים עם 1 mL של בופר שטיפה.

לאחר מכן, השתמש במעמד מגנטי כדי לאסוף את החרוזיים והסר את הנוזל העליון (supernatant). חזור על שטיפה זו שש עד שמונה פעמים. בצע שטיפה סופית עם 1 mL של TE בתוספת 50 mM sodium chloride.

סבבו את החרוזים במיקרו-צנטריפוגה לאחר הצנטריפוגציה, ושאבו כל שארית של TE buffer. לאחר מכן, הוסיפו 100 µL של elu buffer לדגימות. בצעו זאת מיד לאחר מכן.

דגרו את הדגימות בטמפרטורה של 65 °C למשך 10 עד 15 דקות. שפשפו את המבחנות כנגד מעמד למבחנות של 1.5 ml בכל שתי דקות כדי לשמור על החרוזים בתגליה. אספו את החרוזים באמצעות סנטריפוגציה ומעמד מגנטי והעבירו את ה-SNAT למבחנת PCR.

לאחר מכן, הוצא את דגימת הקלט (input) שנשמרה קודם לכן והוסף שלושה נפחים של באפר אלוציה. לבסוף, הכנס את דגימות ה-IP והקלט למחזור תרמי למשך הלילה בטמפרטורה של 65 °C. כדי לבטל את הקשירה הצולבת (cross linkages) למחרת, הוסף נפח אחד של באפר TE לדגימות.

לאחר מכן, הוסיפו RNAs A עד לריכוז סופי של 0.2 micrograms per microliter. דגרו את הדגימות בטרמיקלר במשך שעה עד שעתיים בטמפרטורה של 37 degrees Celsius. לאחר הדגירה, הוסיפו proteinase K עד לריכוז סופי של 0.2 micrograms per microliter.

לאחר מכן, דגרו את הדגימות במחזור תרמי בטמפרטורה של 55 °C למשך שעתיים. לאחר מכן, בצעו מיצוי של הדגימות פעם אחת באמצעות נפח אחד של פנול. בצעו מיצוי שני של הדגימות באמצעות נפח אחד של תמיסת פנול-כלורופורם-אלכוהול איזואמיל.

בסיום, בצעו מיצוי של הדגימות פעם נוספת עם נפח אחד של כלורופורם איזואמיל אלכוהול. לאחר מכן, הוסיפו 30 micrograms של גליקוגן לכל דגימה. כמו כן, הוסיפו נתרן כלוריד עד לריכוז סופי של 0.2 molar ושני נפחים של אתנול לדגימות.

דגרו אותם למשך 30 דקות בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, סובבו את הדגימות במצנטריפוגה ושפכו את הנוזל העליון. שטפו את המשקעים ב-500 µL של 75% ethanol, לאחר מכן ייבשו את המשקעים והמיסו אותם מחדש ב-40 µL של מים.

כדי לבדוק את גדלי מקטעי ה-DNA שהופקו בתהליך הסוניקציה (SONICATION), טענו חמישה מיקרוגרם של דגימת הקלט המזוקקת לג'ל אגרוז בריכוז 1.8% והריצו את הג'ל. תהליך הסוניקציה אמור להפיק מקטעים בטווח של 150 עד 350 זוגות בסיסים. עם זאת, אם המקטעים אינם נמצאים בטווח זה, יש להתאים את תהליך הסוניקציה על ידי שינוי מספר הפולסים והאמפליטודה לפני הגברת ה-DNA הגנומי.

בדוק את הגודל, הריכוז וההעשרה של הדגימות כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. כדי להתחיל בהגברה של ה-genomic DNA, השג 34 µL מדגימת ה-IP ו-200 ng מדגימת ה-input. בצע הוספת זנב (atail addition) ותיקון, וליגציה של מתאמים למקטעי ה-DNA באמצעות ערכה להכנת דגימות genomic DNA של Illumina, כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב.

טהרו את ה-DNA באמצעות ערכה לטיהור PCR מסוג mini lut ולאחר מכן בצעו אלוציה בבופר EB שחומם מראש ל-50 °C. השתמשו ב-23 µL וב-46 µL עבור דגימות ה-IP וה-input DNA בהתאמה. הכינו את תגובת ה-PCR באמצעות 23 µL של DNA עם מתאמים ו-25 µL של fusion, DNA polymerase מהערכה.

מיקרוליטר אחד של 20 micromolar של sole PCR one ומיקרוליטר אחד של 20 micromolar של So PCR two. בצע את תגובת ה-PCR כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. לאחר הגברת ה-PCR, טהר את ה-DNA באמצעות ערכת ה-Qiagen mini loop PCR purification kit.

חמם מראש 15 µL של בופר EB ל-50 °C ודלל את ה-DNA; דלל 0.5 µL של הדגימה ביחס של 1:4 ובצע קריאת NanoDrop כדי לטהר את התוצרים המוגברים. הכן ג'ל AGROS בריכוז 1.8% בנפח של 50 mL באמצעות מים בדרגת HPLC, והוסף TAE וברומיד לאחר שה-agros נמס. לאחר מכן, צוק את הג'ל וטען אותו.

לאחר הוספת ארבעה µL של loading buffer לדגימות ה-input וה-IP, הרץ את הג'ל ב-120 volts למשך 45 דקות. נתח את הג'ל לאחר ההרצה. התוצאות צריכות להראות כי נוצרו מקטעים בטווח שבין 150 ל-350 base pairs.

הם מייצגים מקטעי DNA גנומי באורך שבין 50 ל-250 זוגות בסיסים. בעזרת סכין מנתחים (scalpel), חתוך מהג'ל את האזור המכיל את החומר בטווח של 150 עד 350 זוגות בסיסים. הקפד להימנע מחיתוך של פס האדפטר, הנמצא בערך ב-120 זוגות בסיסים.

הפיקו את ה-DNA באמצעות ערכה להפקה מהירה של ג'ל (kayak quick gel extraction kit) לפי הוראות היצרן. ייבשו את הדגימה עד לנפח מדויק של 11 µL ב-speed vac ללא חימום. הסירו 1 µL מהדגימה ומדדו את ריכוז ה-DNA באמצעות ספקטרופוטומטר NanoDrop.

לבסוף, זהו תוצרי גנים מועשרים באמצעות מנתח הגנום של Illumina ונתח את אתרי הקישור והגנים המטרה כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. קואורדינטות גנומיות של אזורי קישור מועשרים שזוהו של חלבון הקישור RB two או RBP two מוצגות בפורמט לפי כרומוזומים. ניתן להציג חפיפות של גני ensemble בכרומוזומים כסמני VAR שחורים.

כאן מוצגת התפוסה של כרומוזום 10, כאשר אזורי קישור של rbp two מוצגים כקווים אנכיים. הפאנל האמצעי מציג את כל אזורי הקישור של איזופורמי rbp two בכרומוזום 10, והפאנל התחתון מציג את אזורי הקישור של האיזופורמה הגדולה של rbp two. מידע זה מספק סקירה כללית של תפוסה חופפת וספציפית של איזופורמי RBP two בכרומוזום 10.

כאן מוצג מפת חום עם קטגוריות של תפקודי מולקולריים ב-gene ontology או go המועשרות באופן מובהק, עם תיקון של שיעור התגליות השגויות או FDR, בקרב הגנים הקשורים ל-rbp. שני גוונים הנוטים לאדום מעידים על מובהקות סטטיסטית גבוהה. צהוב מעיד על מובהקות סטטיסטית נמוכה, ואפור מעיד על היעדר מובהקות סטטיסטית.

ניתוח העשרה מראה את התפקודיים המולקולריים החופפים והספציפיים לאיזופורמים של שני הגנים שהם מטרות של R BP. הרגע הצגנו בפניכם כיצד לזהות אתרי קישור של גורמי שעתוק במהלך הליך זה. חשוב להפיק מקטעי DNA בטווח הגדלים ובתשואה המתאימים.

ניתן להשיג זאת על ידי מעקב אחר ההנחיות שלנו במהלך שלב ה-SONICATION. וזהו זה. בהצלחה בניסוייכם ותודה שצפיתם.