אלגוריתם רומן ייס שינוי נקודות לניתוח הגנום רחב, של סוגי נתוני ChIPseq מגוונים

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא להשתמש בצפיפות של מיקומי הקריאות הממופות מנתוני ריצוף של שיקוע חיסוני של כרומטין (chromatin immunoprecipitation sequencing) כדי להעריך את ממוצע הצפיפות הפוסטרי של הקריאות לאורך הגנום. דבר זה מושג באמצעות עיבוד מקדים של קריאות ה-ChIP-seq הממופות לפרופילי צפיפות בחלוקה לבלוקים, כאשר מספר זהה של קריאות נופל לתוך סלים (bins) לא חופפים של 200 זוגות בסיסים.

בשלב שני, סלילים (bins) סמוכים בעלי צפיפות זהה ממוזגים לבלוק גדול יותר, ולאחר מכן מחושבים באופן רקורסיבי צפיפויות ממוצעות אחוריות (posterior mean densities) של כל בלוק בהקשר של כל הבלוקים הסובבים אותו, תוך שימוש במודל בייסיאני עם מסננים קדמיים ואחוריים. במודל זה, מספר הקריאות עבור בלוק מיוצג על ידי התפלגות פואסון עם פרמטר theta, המקבל התפלגות קדם של גמא עם פרמטרים alpha ו-beta. לאחר מכן, הערכות הצפיפות הממוצעת האחורית של כל בלוק נבדקות למשמעותיות על סמך השאלה האם הן עולות על הכמותיל ה-90 ביחס לצפיפות הרקע של בקרת הקלט, וזאת כדי להפיק את תוצאות מקטעי הגנום המועשרים הסופיות. התוצאות המתקבלות ממחישות את התהליך מקריאות רצף גולמיות, דרך הערכות צפיפות קריאות ממוצעת אחורית, ועד לאיים מועשרים בנתוני ChIP-seq במהלך ניתוח BCP.

יתרה מכך, התוצאות מראות כי BCP עולה בביצועיו על הכלי המתחרה cer. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו CER הוא ש-BCP משתמשת בהתקדמויות ה-A העדכניות ביותר במודלים של סממנים חבויים, ולכן היא מאפיינת טוב יותר את הניואנסים של ניתוח נתוני chipsy מאשר שיטות היוריסטיות קודמות. שיטה זו יכולה לסייע במענה על שאלות מפתח בתחום האפיגנומיקה, כגון תפקידן של מודיפיקציות של histo, באמצעות אפיון תבניות ההעשרה שלהן ברחבי הגנום.

למרות ששיטה זו עבור מטופל יכולה לספק תובנות לגבי ניתוח נתוני ChIP-seq, ניתן להחיל את המסגרת הבסיסית גם על ניתוח נתונים אחרים של ריצוף הדור הבא, כגון זיהוי אזורים עם מתילציה שונה בנתוני ריצוף ביסולפיט, לוקוסים של שעתוק חדשים ב-RNA-Seq, וריאציות במספר העותקים או כל מספר של נתוני tiling של מיקרו-מערכים. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית להבנה ברורה של המתודולוגיה ושל יתרונותיה. היתרונות התאורטיים חבויים בתוך התוכנה.

כל שלבי הפרוצדורה המוצגים כאן נארזו בתוך קובץ הרצה יחיד בחבילת התוכנה BCP, הזמינה להורדה בסרטון זה. השלבים המבוצעים על ידי התוכנית מתוארים לצורך הרצת התוכנה. נדרשים שלושה פרמטרים.

קובץ המכיל קריאות שמופו באופן ייחודי מדגימת ChIP וקובץ דומה עבור קריאות בקרת קלט (input control), וכן שם קובץ פלט להכנת קובצי קלט עבור ניתוח BCP. ראשית, יש לבצע יישור (align) של הקריאות הקצרות שהופקו מהריצות של הריצוף לגנום הייחוס המתאים באמצעות תוכנת יישור קריאות קצרות מועדפת. יש להמיר את המיקומים הממופים לפורמט BED (Browser Extensible Data) בעל שש עמודות, שבו כל שורה מופרדת בטאב עבור קריאה ממופה אחת ומציינת את הכרומוזום הממופה, נקודת ההתחלה, נקודת הסיום, שם הקריאה, הציון (score) והחוט (strand).

הרחב את מיקומי השבב ומפת הקלט לאורך פagmentים שנקבע מראש. לדוגמה, גודל הפagment שנקבע במהלך עיכול אנזימטי או סוניקציה של ה-DNA, בדרך כלל סביב 200 base pairs. לאחר מכן, מספר הפגמנטים מאוגד בbins סמוכים.

כברירת מחדל, גודל הסל (bin size) מוגדר לפי אורך הפרגמנט המוערך של 200 base pairs. כל נקודת שינוי אפשרית בסט של סלים בעלי מספר קריאות (read counts) זהה תיפול ככל הנראה בגבולות החיצוניים ביותר. בהתאם לכך, לא סביר שנקודת שינוי תתרחש בגבול פנימי בין שני סלים בעלי מספר קריאות זהה.

לפיכך, קבצו סלילים (bins) סמוכים עם מספר קריאות זהה לכל סליל לבלוק אחד. לאחר הכנת קבצי הקלט, הפעילו את אומדן ה-BCP פשוט על ידי הקלדת הפקודה המוצגת בתחתית המסך. צפיפות הקריאות של כל בלוק ממודלת כהתפלגות פואסון עם פרמטר ממוצע theta העוקב אחר תערובת של התפלגויות גמא עם פרמטרים alpha ו-beta, והסתברות מוקדמת להתרחשות נקודת שינוי בכל בלוק.

הגדרת גבול של P המתנה את כל בלוק באופן זה הופכת למעשה את המודל למודל מרקוב נסתר (HMM) עם מספר מצבים אינסופי. ההיפר-פרמטרים alpha, beta ו-P מוערכים באמצעות סבירות פוסטריורית מקסימלית. אומדני בייס (Bayes estimates) מחושבים במפורש עבור כל בלוק theta sub T כתוחלת של theta sub T בהינתן why sub T. מסנני ה-forward וה-backward המסורתיים יותר אך הגוזלים זמן, המשמשים לעיתים קרובות ב-HMM, מוחלפים בקירוב תערובת בעל סיבוכיות חסומה (bounded complexity mixture approximation) יעיל יותר מבחינה חישובית, כדי להעריך את הממוצעים הפוסטריוריים theta hat sub T. הממוצעים הפוסטריוריים המתקבלים יחולקו לפרופיל מקטעי קבוע מקורב, כך שבלוקים עם theta hat sub T זהה יקובצו יחד לבלוקים גדולים יותר עם קואורדינטות גבול מעודכנות.

BCP משתמש במספר הקריאות (reads) המוזנות לבלוק כקצב הרקע וקובע את מידת ההעשרה. הדבר נעשה באמצעות מבחן השערה פשוט, המבוסס על השאלה האם צפיפות הממוצע במיקום השבב עבור בלוק מסוים עולה על סף מובהקות מסוים. הרבעון ה-90 הוא סף ברירת המחדל והוא מתאים ברוב המקרים.

לאחר מכן, BCP ממזג בלוקים סמוכים של צפיפות ממוצעת אחורית העולים על רמת ההעשרה לאזור יחיד, ומדווח על הקואורדינטות הממוזגות בדפדפן. פורמט הנתונים המרחיב של BCP מצטיין בזיהוי אזורים של העשרה רחבה בנתוני מודיפיקציות של היסטונים. כאן, תוצאות ה-BCP מושוות לאלו של cser, כלי קיים שהפגין ביצועים חזקים; עבודות קודמות ממעבדה זו שבחנו H3K36 trimethylation הראו נטייה לגודל איים גדול בהרבה ב-BCP מאשר ב-cser.

איים גדולים יותר תואמים יותר לציפייה המקובלת של איים רחבים ומפוזרים של העשרה של H3K36 trimethylation. איים גדולים יותר אינם מעידים על דיוק כשלעצמם. לכן, הקשר הידוע של איי H3K36 Trimethylation עם גופי גנים המתעתקים באופן פעיל, כמו גם הבלעדיות ההדדית שלהם ביחס לאיי H3K27 Trimethylation, שימשו להערכת הביצועים של BCP ו-CER בהשוואה ל-CER. BCP זיהה איים רציפים גדולים יותר שלכדו טוב יותר את גופי הגנים מבלי להגדיל את החפיפה עם איי H3K27 trimethylation.

BCP שומר על חפיפה גבוהה של גנים פעילים על ידי איים של H3K36 trimethylation עם גבולות המיושרים מקרוב לגופי הגנים, ללא הגדלת מידת החפיפה של חיוביים שגויים עם גנים במרחב הבינ-גני בעלי תעתוק מודחק או עם סימן הדיכוי H3K27 trimethylation; בעת הערכת השחזור של זיהויי איים על ידי BCP בשני מערכי נתונים מקבילים, נצפה כי BCP לא סבל מתלות כבדה בעומק כיסוי הקריאות (read coverage depth) בניגוד לאלגוריתם המתחרה CSER. ראיות נוספות לחוסנו ולשחזוריותו של BCP ניתנו על ידי בחינת אזורים נפרדים נוספים, שהדגימו גבולות איים עקביים למרות עומק כיסוי מופחת. כדי להדגים באופן מלא את הרב-גוניות של BCP, הושגו נתונים על קשת רחבה של מודיפיקציות היסטונים, כולל הסימנים הנקודתיים H3K27 acetylation, H3K9 acetylation, ו-H3K4 trimethylation, והסימן הדיפוזי H3K9 trimethylation, בנוסף ל-H3K27 trimethylation ו-H3K36 trimethylation. מערכי נתונים אלו נותחו באמצעות הגדרות הפרמטרים ברירת המחדל הן עבור BCP והן עבור CSER.

במרכז נמצא העשרה של H3K36 trimethylation בגן PXDN המסמנת שעתוק פעיל, אשר יורדת כמצופה באתר תחילת השעתוק. הסימונים הפעילים הנקודתיים הנוספים הם H3K27 acetylation, H3K9 acetylation ו-H3K4 trimethylation. מיד במורב של PXDN נמצא מרחב בין-גני מדומם המסומן על ידי העשרה של H3K27 trimethylation; באגף הנגדי נמצא גן מדומם על ידי H3K27 trimethylation. נתקדם צעד אחד נוסף החוצה.

הכרומטין המושתק שלנו, כפי שמעידה נוכחותם של העשרה של H3K9me3, נראה כמעיד על השתקה של SNTG2 ו-MYT1L, אולי באופן פחות זמני מאשר דיכוי על ידי H3K27me3. אזור זה כולל את מרבית התופעות הנתקלות ב-ChIP-seq של מודיפיקציות היסטונים. הוא ממחיש כיצד הטבע הדינמי של BCP יכול לזהות הן סימני אצטילציה ו-H3K4me3 נקודתיים, ובו-בזמן להבחין בין איים רציפים גדולים של דיכוי H3K27me3 ו-H3K9me3, לבין שעתוק פעיל של H3K36me3.

ניתן לבצע אלגוריתם זה בערך במשך 30 דקות, תלוי במספר הקריאות ובתוצאות סימני הגנום. כל אופטימיזציה משמעותית, כפי שנדרש לעיתים קרובות בשיטות אחרות, תתבצע בעקבות הליך זה. ניתן לחקור חלבונים מטרים שונים של שיקוע חיסוני של כרומטין באמצעות BBCP, כולל מודיפיקציות היסטון שונות וכן גורמי שעתוק נקשרי DNA, כדי לענות על שאלות נוספות לגבי מנגנונים אפיגנומיים ובקרת גנים.

לאחר צפייה בסרטון זה, תגמרו עם הבנה טובה של האופן שבו BCP משמש לזיהוי אזורים נגישים לסימוני היסטון דיפוזיים בניתוח נתוני ChIP-seq.