אוראלית של Rotenone באמצעות Gavage וניתוח מקדימה של Alpha-synuclein תכלילים במערכת העצבים enteric

התסמינים של מחלת פרקינסון, הכוללים ליקויים בתפקוד המוטורי ובדיבור, נובעים מפעילות מופחתת של תאים מפרישי דופמין במוח. מערכת העצבים האנטרית והבצילול ריח הם המבנים העצביים החשופים ביותר והראשונים להיות מושפעים. מחלת פרקינסון נקשרה לחשיפה לחומרי הדברה.

על מנת לנתח את השפעותיהם של חומרי הדברה על מערכת העצבים האנטרית, מוזן חומר ההדברה roone לעכברים באמצעות זריקה פומית (oral gavage). לאחר מכן, העכברים עוברים פרפוזיה תוך-לבבית עם 4% paraform, aldehyde של המוח ומערכת העצבים האנטרית. הרקמה מופקת, מוכנה ונצבעת אימונוהיסטוכימית עבור חלבונים הקשורים ל-PD.

תמונות של Beta three tubulin ו-alpha synuclein שהושגו באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית מדגימות הצטברות של alpha synuclein בתוך נוירונים של מערכת העצבים האנטרية בבעלי חיים שנחשפו לחשוף לחומרי הדברה. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון מתן סיסטמי של rotenone, הוא שבשימוש בטכניקה זו מובטח שהשפעתו של rotenone תוגבל למערכת העצבים האנטרية. שיטה זו עשויה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח במחלת פרקינסון, כגון האטיולוגיה שלה והמנגנונים העומדים בבסיס התקדמותה.

להשלכות של טכניקה זו יש השפעה על הטיפול והאבחנה של מחלת פרקינסון, שכן היא תאפשר פיתוח של מטרות טיפוליות ושיטות אבחנה חדשות. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי הפתופיזיולוגיה של מחלת פרקינסון, ניתן ליישם אותה גם על מערכות אחרות, כגון מחקר של השפעת רעלים סביבתיים אחרים על מערכות העצבים האנטריות, הסימפתטיות והפרא-סימפתטיות, וכן על דופן המעי. באופן כללי, אנשים שאינם מנוסים בשיטות אלו יתקלו בקשיים, שכן נדרש זמן מסוים כדי לשלוט בביצוע ה-gavage.

הרעיון לשיטות אלו עלה בדעתי לראשונה כאשר קראתי על הקשר בין חומרי הדברה למחלת הפרקינסון. כמו כן, היה מועיל לצפות בוועידה של CORAs במסגרת הקונגרס העולמי לפרקינסון בברלין בשנת 2005. יש צורך בהדגמה שלמה של שיטה זו.

השיטה למתן ol באמצעות זונד קיבתי (gavage) היא קשה מכיוון שלעכברים יש מערכת אנטומית שונה מזו של בני אדם; מצד שני, ניתוח התמונות בוצע באמצעות שלבים מותאמים אישית עבור תמונות אלו. התחילו את הפרוטוקול בשקילת בעל החיים. חשבו את הנפח המתאים של rotenone.

נדרש 0.01 milliliters לכל גרם ממשקל בעל החיים, דבר התואם למינון roone של חמישה milligram ל-kilogram. מלא מזרק של one milliliter בתמיסת roone, ולאחר מכן מלא מזרק שני בתמיסת ה-vehicle. הרם את העכבר והחזק את זנבו ביד אחת.

מתחו את עור הצוואר על ידי משיכה באמצעות שתי האצבעות הראשונות של היד השנייה. ברגע שהראש מקובע בין שתי האצבעות, הישענו אותו כנגד כף היד והפכו אותו למצב הפוך. קבעו את הזנב.

בעזרת האצבעות הרביעית והחמישית, תוך שמירה על הראש לכיוון האחור, לחצו על החיך כדי לפתוח את פיו של העכבר. הכניסו בעדינות את קנולת ההזנה (gavage) אל תוך הפה. הזיזו את הקנולה באיטיות לכיוון הקיבה עד להחדרת אורכה המלא.

כדי למנוע חדירה של חומר לריאות, הניחו את תמיסת ה-roone או את הנשאי (vehicle) על ידי לחיצה עדינה על הבוליס. עם סיום הפעולה, הוציאו באיטיות את סונדת ההזנה (gavage) והחזירו את החיה לכלוב אחר עד לסיום הטיפול בכל בעלי החיים מאותו כלוב. בעקבות הטיפול, העכברים יעברו פרפוזיה תוך-לבבית עם 4% paraform aldehyde.

ב-PBS, המעיים מופקים על ידי דיסקציה ומונחים ב-15% sucrose למשך הלילה. למחרת, הרקמה מועברת ל-30% sucrose ומודגרה שוב למשך הלילה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הרקמה מושמת במקפיא של מינוס 80 מעלות צלזיוס ונשמרת עד לשימוש. באמצעות קריוסטט, נחתכים פרוסות מעי בעובי של 20 micron.

חתכים רוחביים מועברים לשקופיות, ולאחר מכן מבוצעים הליכי חסימה וצביעה אימונוהיסטוכימית. השלבים מבוצעים באמצעות נוגדנים ל-beta three tubulin ו-Antifa synuclein. מומלץ שגורם חיצוני יבצע ניתוח עיוור של הנתונים.

כדי להתחיל בניתוח, פתחו את תוכנת Fiji. פתחו את קובץ תמונת המיקרוסקופ הקונפוקאלי. לאחר מכן, הפרידו את הערוצים כדי שיהיה ניתן לעבוד על כל ערוץ באופן עצמאי.

סגרו את הערוצים שאינם בשימוש ובחרו ב-analyze, לאחר מכן הגדירו את ה-set, ה-scale, וקבעו את גודל הפיקסל ל-one. הגדירו את ה-known distance ל-0.13 ולחצו על global. כעת יסומן גודל התמונה במיקרונים.

בחרו את הערוץ של alpha synuclein ובחרו את הגנגליון. ודאו שהבחירה מקיפה את הגנגליון בכל הפרוסות. שכפלו את התמונה כאשר רק הגנגליון נבחר; תשוכפל תמונה בגודלו של הגנגליון בלבד.

לחצו על עריכה; השטח שמחוץ לאזור הנבחר בתמונה יהפוך לשחור. שכפלו את התמונה שוב כדי לקבוע עד כמה הפרוצדורה הצליחה. אין להשתמש לניתוח תמונות בתמונות בעלות יחס נמוך בין האות לרעש הרקע.

בחר ב-image adjust threshold. לאחר מכן בחר ב-max entropy. לאחר מכן עבור על הפרוסות בתמונה החתוכה ובמקורית כדי לוודא שהתהליך בוצע כהלכה.

סף הטרופיק (tropic threshold) בוחר רמת אות של עוצמה על בסיס ההיסטוגרמה של התמונה, ורק פיקסלים עם עוצמה הגבוהה מסף זה יוצגו בתהליך בחירה של תמונה לבנה על רקע שחור. לאחר מכן לחצו על smooth. שלב זה הופך את הקצוות הפיקסליים של התמונות לקצוות חלקים בתהליך הבחירה.

לאחר מכן לחצו על binary ובחרו ב-Make binary. התמונה תוצג כתמונה בשחור על רקע לבן; כדי לבצע את השלב הבא על העתק של התמונה, לחצו על analyze ולאחר מכן על analyze particles. לאחר מכן בחרו ב-show outlines ולחצו על summarize.

את שאר ההגדרות יש להשאיר כברירת המחדל. פונקציה זו מזהה את המספר הכולל של פיקסלים עם אות ואת אלו המקובצים יחד כשטח הפנים הכולל של פיקסלים עם אות. בנוסף, מדווחים מספר קבוצות הפיקסלים והגודל הממוצע.

השוו ובחרו את הפרוסה בעלת השטח הכולל הגדול ביותר המתאימה באופן טוב. הפרוסה תסומן. העתיקו את טבלת הנתונים עם שטח הפנים הכולל של alpha synuclein, מספר התוך-כלות (inclusions) וגודל החלקיקים הממוצע.

הדביקו את הנתונים בגיליון Excel או רשמו אותם במקום אחר. חזרו ל-Fiji. אתרו את הפרוסה שנבחרה קודם לכן בערוץ ה-beta tubulin ובחרו אותה.

בחר את אזור הגנגליון ולחץ על analyze. לאחר מכן בחר ב-measure. תופיע טבלה נוספת המציגה את השטח הכולל של הגנגליון.

חלץ את הנתונים מהטבלה לגיליון אלקטרוני של Excel בסמוך למדידת ה-alpha synuclein או העתק אותם למקום אחר באמצעות Excel. חלק את הפרמטרים השונים שהתקבלו במדידת ה-alpha synuclein בשטח הגנגליון כדי לקבל את סך ה-alpha-synuclein למשטח ואת מספר ההכלילה (inclusion number) מנורמל לפי גודל הגנגליון, וזאת כדי לנתח את ההשפעות של rotenone הפועל באופן מקומי על מערכת העצבים האנטרית. מינון של 5 mg/kg של קוטב ההדברה rotenone ניתן באמצעות זריקה פומית (oral gavage) לעכברי C 57 black six בני שנה. הכרומטוגרמה המוצגת כאן מראה נוכחות של שיא (peak) של rotenone שעה לאחר המתן. עכברי ביקורת טופלו ב-20 mg/kg של rotenone ו-5 mg/kg של rotenone.

רמות Rotenone נקבעו עבור תמציות של דם, מוח וגזע המוח באמצעות HPLC כפי שמוצג כאן. מתן של חמישה מיליגרם לקילוגרם של rotenone באמצעות הזנה פומית (oral gavage) אינו מוביל לרמות מדידות בדם שעה, שעתיים או שלוש שעות לאחר הטיפול, כפי שנקבע באמצעות HPLC. גרפיקה זו מראה את רמות ה-rot במוח ובגזע המוח של עכברים שטופלו.

שעה לאחר מתן מינון של 10 מיליגרם לקילוגרם או פחות של rotenone, לא נמצאו רמות של rotenone בדגימות של המוח או גזע המוח. שעה לאחר המתן, נמדדה פעילות של mitochondrial complex one בדגימות שריר ומוח של עכברים בני 1.5 חודשים שקיבלו טיפול. לא נמצא הבדל משמעותי בין הקבוצות, דבר המעיד על היעדר עיכוב של mitochondrial complex one, ובכך אושש כי לא היה rotenone באזורים אלו.

ניתוח של alpha synuclein, מרכיב גוף לוי במחלת הפרקינסון, לאחר מתן rone, מאפשר קביעה מהימנה של הכמות הכוללת של alpha synuclein על פני השטח, נוכחות של הכלות (inclusions) של alpha synuclein, ותבנית ה-alpha synuclein בתא. איור זה מציג צביעה של anti beta three tubulin, alpha synuclein ו-DAPI בחתכים של התריסון (duodenum) והמעי העקום (ileum), כפי שניתן לראות כאן. טיפול של 1.5 חודשים ב-roach known גרם להגברת תבנית נקודתית (punctate pattern) של alpha synuclein בתוך גנגליונים של מערכת העצבים האנטרלית, אפילו בהשוואה לקבוצות ביקורת של שלושה חודשים.

ניתן לראות תבנית זו הן באילאום והן בתרישקה. לאחר שלושה חודשי טיפול, ניתן לראות היווצרות של הכללות alpha synuclein גדולות יותר; צביעה אימונופלורסצנטית באמצעות anti alphas synuclein, theof, flavin ו-DPI מדגימה הצטברות של משקעי alpha synuclein גדולים יותר רק בשלושה חודשים. ניסוי זה נותח באמצעות שיטות של סגמנטציה אוטומטית וסף מבוסס אנטרופיה.

בגרף משמאל, כל עמודה מייצגת את סך השטח של alpha synuclein ביחס לשטח הגנגליון. בגרף מימין, כל עמודה מייצגת את המספר הכולל של הכללות alpha synuclein לכל שטח גנגליון שנדגם. יחד, נתונים אלו מעידים כי מתן מקומי של rotenone משרה פוספורילציה, הצטברות ואגרגציה של alpha synuclein עם גליוזיס בגנגליונים של מערכת העצבים האנטרית. לאחר השליטה בטכניקה, ניתן לבצעה בדקה אחת לבעל חיים, אם היא מבוצעת כהלכה.

בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב להחדיר את קטטר ההזנה (gavage) בעדינות, ובמקרה של היתקלות במכשולים, עדיף להוציאו ולהחדירו שוב בהתאם להנחיות אלו. ניתן לבצע שיטות נוספות כגון HPLC, צביעה אימונוהיסטוכימית ואנליזה של תמונות. הדבר יאפשר לנתח אזורים אחרים, את השפעות החומר, או אף את נוכחות החומר בדם לאחר פיתוחו.

טכניקה זו סללה את הדרך עבור מדעני מוח לחקור את השפעותיהם של נוירוטוקסינים סביבתיים על מערכת העצבים האנטרית. לאחר צפייה בסרטון זה, תוכלו להשתמש במד המידה בצורה נכונה ולנתח את התמונות המתקבלות מהאימונוכימיה. זכרו כי עבודה עם חומרים רקובים עלולה להיות מסוכנת ביותר.

לפיכך, אנו ממליצים להשתמש בכפפות ובמסכות בעת ביצוע פרוצדורה זו.