ויזואליזציה של עצבים המגזרי הזחל ב 3 ^Rd Instar תסיסנית הכנות הזחל

ניתן לחקור הובלה אקסונלית על ידי ויזואליזציה של העצבים הסגמנטליים של הזחל. זבוב פירות (drosophila) בשלב ג' של השלב הטרסלי. ראשית מבצעים דיסקציה לזחל, תוך חשיפת מערכת העצבים המרכזית (CNS) מבלי לפגוע באונות האופטיות, בגנגליון הוונטרלי ובעצבים הסגמנטליים.

השלב השני של הפרוצדורה הוא קיבוע הלבה בפורמלהיד לפני דגירה עם נוגדן ראשוני למשך לילה ועם נוגדן משני למשך שעה בחושך. לאחר מכן הלבה מורכבת על עלית זכוכית לבחינת פגמים בהובלה אקסונלית. ניתן לבחון לוקליזציה של חלבונים והתפלגות חלבונים באמצעות מיקרוסקופיה של אימונופלואורסצנציה.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי הובלה אקסונלית, ניתן ליישמה גם על מערכות אחרות כגון מורפולוגיה של סינפסות ושרירים. בדרך כלל, אנשים שאינם מכירים את השיטה יתקלו בקשיים, כיוון שבתחילה קשה לבצע את הדיסקציה המותרת, ובמיוחד לשמור על השרירים והעצבים הסגמנטליים של המוח שלמים. כדי להתחיל בהליך זה, הכינו תמיסת קיבוע של dissection buffer בריכוז one times, תמיסת PBT בריכוז one times, ותמיסת BSA בריכוז 5%.

כפי שפורט בטבלה המוצגת לפני הנתיחה, הכינו זוג פינצטות מספר 5 נקיות, זוג מספריים בעלי להב ישר ונקיים וסיכות לתחילת הנתיחה; השתמשו בכף מיקרוסקופית כדי לאסוף זחלי כוכב בשלישי בגינום ספציפי אל תוך צלחת פטרי. לאחר מכן, שטפו את הזחלים על ידי שטיפה בצלחת פטרי מלאה במים דאיוניים כדי להסיר את כל השאריות של המזון.

בשלב הבא, הניחו זחוח על צלחת הגארד (guard dish) כאשר הצד הגבי פונה כלפי מעלה. הצמידו את הזחוח בעזרת סיכות בקצוות הקדמי והאחורי. טפטפו טיפה אחת של תמיסת ביעור לניתוח חד-פעמי על הזחוח המוצמד באמצעות מספריים עדינים.

גזרו את הלבה בקו האמצע הגבי קרוב לקצה האחורי. בעזרת המספריים, חתכו את קוטיקולת הלבה מהקצה האחורי ועד לקצה הקדמי. טפטפו טיפה אחת של תמיסת דיסקציה 1X על הלבה שבוצעה לה דיסקציה.

בעזרת סיכה, הרים קצה לטרלי אחד של הקוטיקולה סמוך למרכז הלארבה והקבע את הקוטיקולה באמצעות סיכה נוספת. השתמש בשתי סיכות בכל צד לטרלי, כפי שמוצג בתרשים. כעת, הסר בזהירות את המעי, את גופי השומן ואת הטרכיאה, כך שיישאר רק המוח עם שתי האונות האופטיות והגנגליונים הוונטרליים.

לאחר קיבוע העצבים הסגמנטליים, יבצעו צביעה בנוגדנים כאשר הזחלים מחוברים לצלחת המגן. הדגרי את הזחלים המפוצלים ב-50 µL של חומר מקבע למשך 30 דקות. החליפי את חומר הקיבוע מדי 15 דקות. לאחר הקיבוע, שטפי את הזחלים ב-1x PBT למשך 30 דקות.

בעת החלפת התמיסה המבfר בכל 10 דקות, חשוב להקפיד שהזחלים יהיו תמיד טבולים בתמיסת הבאפר. הכינו את תמיסת הנוגדן הראשוני על ידי דילולו לריכוז המתאים בתמיסת 5%BSA. הריכוזים האופטימליים משתנים בין נוגדים שונים.

בנו תא לחות על ידי ריפוד של צלחת פלסטיק עם נייר Kim. נגבו בנייר ספוג במים. החליפו את האחרון פעם אחת PBT.

שטפו עם תמיסת הנוגדן הראשוני שהוכנה והדגירו בתא לחות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה עד למחרת. שטפו את הזחלים המנוסחים ב-1x PBT למשך 30 דקות, תוך החלפת הבאפר בכל 10 דקות. הכינו את הנוגדן המשני על ידי דילולו לריכוז המתאים בתמיסת 5% BSA.

עטפו את תא הלחות בנייר אלומיניום, מכיוון שחלק מהנוגדנים המשניים רגישים לאור. דגרו את הזחלים עם תמיסת הנוגדנים המשניים בטמפרטורה של 25 °C למשך שעה. עם סיום הדגירה עם הנוגדן המשני, שטפו את הזחלים ב-1x PBT למשך 30 דקות, תוך החלפת הבאפר בכל 10 דקות, והמשיכו להרכבה ולהדמיה של הזחלים המפוצעים לפני הרכבת הזחל על השקופית.

הכינו את הזכוכית by מריחת שני קווים אנכיים של לק ציפורים במרכז, עם מרווח גדול מספיק להנחת זכוכית כיסוי כפי שמוצג בדיאגרמה. המתינו לייבוש מלא של לק הציפורים. לאחר שהלק התייבש, הניחו טיפה של תמיפת קיבוע (mounting buffer) במרווח שבין קווי לק הציפורים האנכיים על הזכוכית, כפי שמוצג בתמונה זו.

השקופית מוכנה כעת להרכבה. הוצא את הזחלים לאחר שחלף הזמן שנקבע ל-PBT עבור האחרון שבהם. שטוף והסר בעדינות את הפינים הצדיים מהזחל.

הקפידו שלא לקרוע את הקוטיקולה בזהירות. הסירו את שני הסיכות הנותרות, אספו את הזחל בעזרת פינצטה והניחו אותו על השקופית שהוכנה. ודאו שהזחל אינו הפוך ושהוא מונח בצורה גבית (ventral).

הנח בעדינות זכוכית כיסוי בחלק העליון ואטום את הקצוות בלק מברק כפי שמוצג כאן. הזחלים מוכנים כעת לצפייה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. תמונה מייצגת זו היא של זחל מסוג wild type שצבעו באנטיגנים נגד חלבון של ואסיקולות סינפטיות, cystine string protein.

העצבים הסגמנטליים של lava נצבעים בצורה חלקה. כאן, מוטנט של חלבון מוטורי lava נצבע באמצעות נוגדנים נגד CSP. העצבים הסגמנטליים מראים הצטברויות מאסיביות שנצבעות בבהירות עבור CSP.

בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לשמר את העצבים הסגמנטליים המחוברים למוח ולהשאיר את השרירים שלמים. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה של אופן הדיסקציה. קבעו דגימה שלישית לצביעה אימונוהיסטוכימית והתחילו בבדיקת העצבים הסגמנטליים של הזחלים כדי ללמוד על תובלה אקסונלית באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.