בקנה מידה גדול דג הזברה מבוסס ב-vivo מולקולה קטנה מסך
30 בדצמבר 2010
דג הזברה התפתחה חזקה In vivo פלטפורמה פנוטיפ מבוססי מסכי סמים אנליזה כימית גנטית. הנה, אנחנו מדגימים שיטה פשוטה, מעשית להקרנה בקנה מידה גדול של מולקולות קטנות באמצעות עוברי דג הזברה.
המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לגלות מולקולות קטנות המווסתות באופן ספציפי היבטים מרכזיים של התפתחות עוברית ופיזיולוגיה. דבר זה מושג על ידי הנחת מספר רב של ביצים מופרית בלוחות 96 בארות כשלב שני של סינון. מנות (Aliquots) של ספריית מולקולות קטנות מתווספות ללוחות ה-96 בארות לצד העוברים בלוחות ה-96.
הפלטות של בארות נבחנות לאיתור פנוטיפים שהופעלו על ידי המולקולות הקטנות. התוצאות המתקבלות מראות אילו מולקולות קטנות משפיעות באופן ספציפי על ההתפתחות או הפיזיולוגיה של דגי ה-super fish. שלום, שמי צ'ארלס הונג מהבית ספר לרפואה של אוניברסיטת ונדרבילט.
במעבדה שלנו, אנו מבצעים סריקות כימיות בעתק גבוה באמצעות עוברי דגי זהב. זוהי טכניקה פשוטה יחסית שניתן להתאימה באופן נרחב לגילוי תרכובים ביו-אקטיביים חדשים. אחר הצהריים שלפני יום הסריקה הכימית, הכינו 10 עד 20 מיכלי רבייה לדגי זהב.
הנח מחיצה בכל מיכל ומלא כל מיכל במים ממערכת האקוואקולטורה; העבר באמצעות רשת דגים זכר בוגר אחד ונקבה בוגרת אחת עד שתיים למכל הפנימי. בכל מיכל רבייה, סמן את המיכלים והנח עליהם מכסה בבוקר של הסינון. הסר את המחיצות ממיכלי הרבייה ואפשר לדגי הזברה להזדווג.
במהלך השעה הבאה, אפשרו לביצים המופריות לנפול דרך הרשת שבתחתית של כל מכל פנימי. לאחר שעה, החזירו את דגי ה-seber הבוגרים למכלי האחסון הקבועים.
הסירה את המכל הפנימי ואסוף את הביצים על ידי סינון המים מכל מיכל רבייה באמצעות מסננת תה מפלסטיק. הפוך את המסננת מעל צלחת פטרי ושטוף אותה בעדינות כדי להעביר את הביצים אל צלחת הפטרי. באמצעות בקבוק שטיפה המכיל תווך E three, יש להסיר את כל הביצים שאינן מופיות, הנראות אטומות.
באמצעות פיפטת פלסטיק חד-פעמית, כל הצלבה של זיווג צריכה להניב כ-200 עוברים. לאחר מכן, העבירו בערך חמישה עוברים במדיום E3 לכל באר של פלטה בעלת 96 בארות, באמצעות פיפטת פסטור מזכוכית. לאחר שהעוברים סודרו על פלטה בעלת 96 בארות.
הסיר כמה שיותר ממרקא E three מבארות באמצעות פיפט רב ערוצי (12 ערוצים), תוך הקפדה שלא לנקב את העובריים. בעזרת הפיפט רב הערוצי, הוסף 250 microliters של E three.
הוסיפו למעמקים מצע המכיל 0.5 µg/mL של canmycin במהירות האפשרית כדי למנוע מהעוברים להתייבש. הכניסו את פלטות ה-96 בארות לאינקובטור בטמפרטורה של 28.5 °C עד שיגיעו לשלב הרצוי להוספת התרכובות. בפרוטוקול זה, אנו מחפשים תרכובות המשבשות את התבניות העובריות המוקדמות, ונדגור את העוברים למשך שלוש שעות או עד שמעל 90% מהעוברים יגיעו לשלב של 1000 תאים; ספריות של מולקולות קטנות מסופקות בדרך כלל.
בפלטת מקור של 96 בארות, שבה כל תרכובת מאוחסנת ב-DMSO כחומר מוצא בריכוז 10 millimolar, כ-60 דקות לפני שהעוברים יגיעו לשלב הרצוי, הפשיר מספר מתאים של פלטות 96 בארות המכילות מנות של מולקולות קטנות. רשום את המספר הסידורי או מספר זיהוי אחר של פלטות המקור כדי למזער התעבות על הפלטות. הנח אותן בתא ייבוש המכיל חומר מייבש.
סובב בקצרה את הפלטות בצנטריפוגת שולחנית המצוידת במתאם לפלטות רב-בארות. הסר את סרט האלומיניום מהפלטה המקורית; באמצעות פיפטה בעלת 12 ערוצים, דלל את התרכובות בפלטה המקורית לריכוז הרצוי באמצעות DMSO. בפרוטוקול זה, אנו משתמשים בריכוז סופי של 0.5 millimolar ומוסיפים 4.75 µL של DMSO כדי לדלל את פלטת המלאי בריכוז 10 millimolar.
כאשר העוברים בפלטת 96 הבארות מגיעים לשלב הרצוי, השתמשו בפיפט 12 ערוצים כדי להעביר 2.5 µL של תרכובות מפלטות המקור לפלטות המקבלות המכילות את העוברים. כסו את הפלטות המכילות כעת את העוברים והתרכובות במכסים, ורשמו את מספר הזיהוי של פלטות המקור על פלטות העוברים. ערבבו את הפלטות באמצעות סיבוב עדין והניחו אותן באינקובטור בטמפרטורה של 28.5 °C.
כסו כל פלטת מקור המכילה מולקולות קטנות שאינן בשימוש בתקרת אלומיניום, הדביקו בסרט דביק והניחו במקפיא של 80- מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך. לפני ביצוע הסריקה הוויזואלית, הגדירו קריטריון ספציפי לזיהוי "להיט" (hit). לדוגמה, בסריקה למולקולות קטנות המעכבות את התפתחות המוח, "להיט" עשוי להיות תרכובת הגורמת לאובדן של המוח הקדמי.
היעדר עיניים הוא אינדיקטור ויזואלי פשוט לאובדן של המוח הקדמי (forebrain) ואינו דורש פלואורסצנציה לצורך בדיקה בנקודות זמן רצויות במהלך ההתפתחות. הוצא את פלטות 96 הבארים המכילות עוברים שטופלו בתרכובות מהאינקובטור ובדוק כל באר תחת מיקרוסקופ סטריאו; כאשר מבצעים סריקה של מעכבים של מולקולות קטנות של התפתחות המוח הקדמי, יש לבחון את הפלטות לאחר 28 שעות כדי לזהות היעדר עיניים כסמן לעיכוב התפתחותי של המוח הקדמי. רשום את זהות הפלטה ומיקום הבאר עבור כל באר שבו לפחות שלושה מתוך חמישה עוברים מראים את הפנוטיפ המוגדר. החזר את פלטת 96 הבארים לאינקובטור.
יש לאשר מחדש את אובדן העיניים והמוח הקדמי לאחר 48 שעות. למרות שלעוברים לא יהיה מוח קדמי, הם ישרידו לפחות ארבעה ימים. יש לאשר מחדש פגיעה פוטנציאלית על ידי בדיקה חוזרת של השפעות התרכובת במספר מינונים; עבור כל מינון, נבדקים 10 עוברים ב-0.5 milliliters של מצע E three בפורמט של פלטה בעלת 48 בארות.
התזמון של הכנת התרכובת לבדיקה חוזרת צריך להיות זהה לזה של הסריקה המקורית. HIIT מאושר כאשר הפנוטיפ שהופעל משתחזר בצורה תלוית-מינון בבדיקה חוזרת של התרכובת. לבסוף, זהו את התרכובת ה-hi מתוך מאגר המולקולות הקטנות בספריה הכימית.
באמצעות סריקה כימית ויזואלית המבוססת על דגי zebrafish, גילינו מולקולה קטנה המעכבת את אות ה-hedgehog, על סמך השפעתה על ציר הגוף. תמונה זו מציגה עוברים שנחשפו למעכב hedgehog המפגינים כיפוף ונטרלי בולט של הזנב. בבדיקה של אותם עוברים לאחר 48 שעות, הם עדיין מפגינים את הפנוטיפ של כיפוף ונטרלי, כפי שנצפה ב-24 שעות.
תמונה זו מציגה עובר שטופל בתרכובת בהשוואה לעובר מוטנטי של מסלול ה-hedgehog. לאחר השליטה בטכניקה זו, אדם אחד יכול לסרוק כ-400 תרכובות בשבוע בתוך מספר שעות בלבד. טכניקה זו סללה את הדרך עבור ביולוגים כימיים לחקור נושאים כגון התפתחות תאים, מסלולי אותיות תאיים והתפתחות עוברית.
בעת עבודה עם מולקולות קטנות שאינן מאופיינות, חשוב להקפיד על בטיחות נאותה ולהשתמש בחלוקי מעבדה ובכפפות, שכן מולקולות לא מאופיינות אלו עלולות להיות מסוכנות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג שיטה מעשית לסריקה רחבת היקף של מולקולות קטנות באמצעות עוברים של דגי זברה. המטרה היא לזהות תרכובות המשפיעות על ההתפתחות העוברית והפיזיולוגיה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- פרמקולוגיה
- ביולוגיה התפתחותית
רקע
- דגי זברה הם מודל בעל ערך לסריקת תרופות.
- הם מאפשרים ניתוח של מולקולות קטנות המבוסס על פנוטיפ.
- ההתפתחות העוברית היא קריטית להבנת תהליכים פיזיולוגיים.
- סריקה רחבת היקף יכולה להאיץ את גילוי התרופות.
מטרת המחקר
- לגילוי מולקולות קטנות המשפיעות על התפתחות עוברית.
- להערכת ההשפעות הפיזיולוגיות של תרכובות אלו.
- שימוש בדגי zebrafish כפלטפורמה in vivo לסריקה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- ביצי דגי זברה מופריות מוצבות בלוחות של 96 בארות.
- ספרייה של מולקולות קטנות מתווספת ללוחות.
- הפנוטיפים נבדקים כדי לזהות תגובות לתרכובות.
- התוצאות מצביעות על המולקולות המשפיעות על ההתפתחות או הפיזיולוגיה.
תוצאות עיקריות
- זיהוי מולקולות קטנות המשפיעות על התפתחות דגי זברה.
- הערכת שינויים פיזיולוגיים בעוברים.
- הדגמת יעילותה של שיטת הסריקה.
- השלכות פוטנציאליות על גילוי תרופות וביולוגיה התפתחותית.
מסקנות
- השיטה מספקת פלטפורמה חסונה לסריקת תרופות.
- עוברי Zebrafish יעילים לחקר תהליכי התפתחות.
- מחקרים עתידיים יכולים להרחיב את הבדיקה של התרכובות שזוהו.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
סריקת מולקולות קטנות בקנה מידה רחב in vivo המבוססת על דגי zebrafish מאפשרת זיהוי מהיר, מונחה-פנוטיפ, של תרכובות ביו-אקטיביות המשפיעות על התפתחות ופיזיולוגיה של חולייתנים. גישה זו מספקת ביטחון ניבוי עבור תיקוף מטרות בשלבים מוקדמים ותומכת במיון פורטפוליו על ידי חשיפת השפעות התרכובות בהקשר של אורגניזם שלם. יכולת ההרחבה והתפוקה שלה הופכות אותה לנכס אסטרטגי עבור צוותי גילוי השואפים להפחית סיכונים במנגנונים ביולוגיים לפני קידום מועמדים.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה ישירה של מסלולי התפתחות ותהליכים פיזיולוגיים במערכת של חולית.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות על ידי קישור חשיפה לתרכובת לתוצאות פנוטיפיות ניתנות לצפייה.
- מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי חשיפת השפעות on-target ו-off-target in vivo.
- מספק פלטפורמה לבדיקה מהירה של השערות על פני ספריות כימיות מגוונות.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- מספק סריקה בעלת תפוקה גבוהה וניתנת לשחזור באמצעות פורמטים סטנדרטיים של פלטות עם 96 בארות.
- מייצר קריאות פנוטיפיות כמותיות ואיכותיות לצורך מיון תרכובות.
- מאפשר הערכה ניתנת להרחבה של ספריות תרכובות לבחינת השפעות התפתחותיות ופיזיולוגיות.
- תומך בפיתוח בדיקות המשך באמצעות זיהוי נקודות קצה פנוטיפיות חסונות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאם ממצאי גילוי מוקדמים עם מסלולים התפתחותיים הרלוונטיים למחלה כאשר הפנוטיפים שמורים.
- מספק רציפות מסריקה in vivo לבחירת מודל פרה-קליני המבוססת על תובנות מכניסטיות.
- מפחית סיכונים בהחלטות קידום על ידי אישור השפעות התרכובת בהקשר של אורגניזם שלם.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
שיטת סריקה זו המבוססת על דגי זברה מגשרת בין שלבי הגילוי המוקדמים לזיהוי מובילים (lead identification), על ידי מתן אפשרות להערכה מהירה, in vivo, של פעילות תרכובות לפני ביצוע מחקרים ביונקים.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקות מונחות-השערה של מולקולות קטנות לצורך מודולציה של מסלולים והשפעה התפתחותית.
- סריקה: מציע בדיקות פנוטיפיות ניתנות לשחזור ובקנה מידה רחב, עם קריטריונים ברורים לזיהוי "פגיעות" (hits) לצורך בחירת תרכובות.
- אנליטיקה: מספקת דירוג פנוטיפי כמותי ואישור של תגובת מינון להשוואה חסונה של נתונים.
- מחקר תרגומי: מסייעת בהתאמת פגיעות ראשוניות לביולוגיה רלוונטית למחלה, כאשר הדבר ישים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה ניתנת לשימוש חוזר ולהתאמה עבור קמפיינים מתמשכים של גנטיקה כימית וגילוי תרופות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מנגנונית בשלבים מוקדמים של הגילוי.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של סריקה בתפוקה גבוהה באמצעות תהליכי עבודה ניתנים להרחבה ולשחזור.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מושכלת לגבי המשך או הפסקה של פיתוח (go/no-go) וניהול פורטפוליו יעיל מבחינת הון.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכון ובקידום של מועמדים שעברו ולידציה.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בגידול דגי זברה, אמבריולוגיה וניתוח פנוטיפי.
- נדרשת גישה לתשתיות לטיפול בפלטות רב-באיריות, אינקובציה ומיקרוסקופיה סטריאוסקופית.
- נדרש סטנדרטיזציה בין-צוותית של קריטריונים לזיהוי "להיטים" (hits) ודירוג פנוטיפי.
- ייתכן שיידרש ביצוע התאמות עבור שלבי התפתחות שונים או נקודות קצה פנוטיפיות שונות.
- פרוטוקולי בטיחות הם חיוניים בעת טיפול במולקולות קטנות שאינן מאופיינות.
שאלות נפוצות בתחום הביופארמה
Chapters in this video
0:05
Title
0:40
Introduction
1:02
Zebrafish Egg Collection and 96-Well Plate Preparatin
2:52
Small Molecule Library
4:23
Screening for Effects of Small Molecules by Visual Inspection of Phenotypes
5:51
Small Molecule Detection with Zebrafish Chemical Screening Assay
6:21
Conclusion
