פיתוח הדמיה ניתוח אוטומטיות עבור מסכי דג הזברה כימיים.
24 ביוני 2010
אנו מדווחים על פיתוח של מערכת הדמיה ניתוח אוטומטי של העוברים מהונדס דג הזברה בצלחות multiwell. זה מדגים את היכולת לאמוד את ההשפעות תלויות במינון של מולקולה קטנה, BCI, על גדילה פיברובלסטים ביטוי פקטור כתב גנים לספק טכנולוגיה להקמת תפוקה גבוהה כימיים מסכי דג הזברה.
בסרטון זה מבוצע סינון בעל תוכן גבוה (high content screening) מבוסס דימות כדי להעריך מודולציה של מסלול ה-Rasm map kinase של גורם השאיפה לפיברובלסטים (fibroblast growth factor) באמצעות מולקולות קטנות. בעוברים של דגי זברופיש, מזברופיש זכר טרנסגני ונקבה מסוג פרא (wild type) מזביעים בכלוב גידול. ביצים מופרות נופלות לתחתית, נאספות ומועברות לצחנת פטרי. העוברים מדגרים למשך לילה, ולאחר מכן מונחים לבארים בודדות בלוח בעל 96 בארות עם תחתית עגולה.
המולקולה הקטנה BCI מתווספת כדי להפעיל באופן מוגבר את סיגנל FGF, והפלטה מדגרה במשך שש שעות. תמונות מכל באר נלכדות באמצעות קורא פלטות קונפוקלי ומנותחות באמצעות אלגוריתם בעיצוב עצמי, המדווח על עוצמות פלואורסצנציה במבנים עובריים ספציפיים. שלום, אני היבה קאדו מהמעבדה של ד"ר מייקל צ'אנג במחלקה למיקרוביולוגיה וגנטיקה מולקולרית באוניברסיטת פיטסבורג.
שלום, אני אנדראה ספוק ממכון גילוי התרופות של אוניברסיטת פיטסבורג. היום נראה לכם את ההליך של רבייה, בחירה וסידור של עוברים של דגי זברה לטיפול כימי. בפלטה של 96 בארות, נשתמש בעוברים טרנסגניים המדווחים על פעילויות של גורמי גדילה מסוג fibroblast growth factor אשר טופלו במולקולה המפעילה באופן יתר מסלול זה.
נראה לכם כיצד אנו משתמשים במתודולוגיית סריקה בעלת תוכן גבוה (high content screening) כדי לרכוש, לנתח ולכמת באופן אוטומטי את הפעילות של גורם הגדילה של פיברובלסטים (fibroblast growth factor) בעוברים של דגי זברה טרנסגניים. הליך זה ידגיש טכנולוגיית פלטפורמה לניצול דגי זברה טרנסגניים וסריקות כימיות בתפוקה גבוהה. אז בואו נתחיל.
יומיים לפני הטיפול, זהו זכרי דגי זברפיש טרנסגניים הומוזיגוטים והעביר אותם למכלי הזדווגות נפרדים. הוסף מפרידים למכלים, לאחר מכן הוסף נקבה מסוג פרא (wild type) לכל מכל והשאר את הדגים בכלובים להזדווגות למשך הלילה בטמפרטורה של 28 degrees Celsius. למחרת בבוקר, הסר את המפריד. לאחר שעה, העבר את הדגים למכל חדש ושפוך את העובריים למסננת פלסטיק.
העבירו את העוברים למנות של 100 מילימטר עם תמיסת E3 והדגירו בטמפרטורה של 28 °C למשך שש עד שמונה שעות. לאחר ההדגרה, בחנו את העוברים תחת מיקרוסקופ סטריאו. עוברים שיהיו מתאימים לניסויים יעברו גזציה.
בשלב זה, יש להסיר עוברים שאינם מופרים, שיישארו בשלב התא הבודד. כמו כן, יש להסיר עוברים שאינם חיוניים, הנראים עכורים או מעוותים. לאחר מכן, יש להוסיף תמיסת E three טרייה ולדגור למשך לילה בטמפרטורה של 28 °C.
ביום למחרת, הניחו את העוברים תחת מיקרוסקופ סטריאופלואורסצנטי כדי למיין את העוברים הטרנסגניים לפי שלב התפתחותי דומה וביטוי אחיד של GFP. עוברי 24 HPF מראים גבול גלוי בין המוח האמצעי לאחורי עם ביטוי GFP עז, ועיניים גבושות עם רשתית גבית חיובית ל-GFP. עוברים אלו פעילים ויזוזו ויתנו תנועות גוף בתוך הקוריון; ניתן להעבירם באמצעות פיפטת פסטור מפלסטיק.
העבירו את 24 העוברים לאחר HPF, אחד בכל פעם, לבארות נפרדות בלוח 96 בארות. בעזרת מיקרו-פיפט, הסירו כל שארית של תמיסת E three מהבארות. לאחר מכן, בעזרת פיפט רב-ערוצי, הוסיפו 200 µL של תמיסת E three לכל בארה.
לאחר מכן, הוסיפו 2 µL של DMSO לכל הבארים בעמודות 1 ו-12. לאחר מכן, הוסיפו 2 µL של BCL שהוכן ב-DMSO באופן הבא: 1 µM לעמודות 2 ו-7, 5 µM לעמודות 3 ו-8, 10 µM לעמודות 4 ו-9, ו-20 µM לעמודות 5 ו-10.
מיקרומולרי לעמודות חמש ו-10. ולבסוף 25 מיקרומולרי לעמודות שש ו-11. כעת כסו את הפלטה בנייר אלומיניום והדגרו אותה במשך שש שעות ב-28 °C.
הוסיפו 10 µL של trica לכל באר כדי להרדיים את העוברים בגיל 30 HPF. לאחר מכן, הכניסו את הפלטה למערכת molecular devices image express ultra תחת תוכנת open meta express. בחרו תצורה עם עדשת Forex וקוטר pinhole מקסימלי.
הגדירו את המיקוד האוטומטי של הלייזר כך שיזהה את תחתית הפלטה וישתמש ב-Z offset אופטימלי שנקבע מראש. כדי לזהות את אזורי העניין, הגדירו את שטח הסריקה כאתר בודד של 2000 על 2000 פיקסלים ללא benning. בחרו את סוג הפלטה המתאים ואת לייזר הארגון ב-488 nanometer בעירור מעל אורכי גל פליטה של 488 מעל 525 nanometers.
לאחר מכן, בחרו באבאר המכילה עובר שטופל בחומר נשאי (vehicle) ולחצו על find sample. המכשיר יבצע סריקת מיקוד אוטומטית ויקלוט תמונה אחת כדי לאשר רכישה תקינה של התמונה. בחרו באקראי אבאר שטופלה בחומר נשאי וקלטו תמונה.
אם התמונה ממוקדת ומראה ביטוי GFP בראש, מקמו את הסמן מעל האזורים הבהירים ביותר ווידאו שעוצמת הפלואורסצנציה היא בטווח של המצלמה בעלת 16 הביטים, כלומר פחות מ-65,000 יחידות.
חזור על שלבים אלו עם בקרת רכב (vehicle control) נוספת ומספר בארות שעובדו עם תרכובת. אם יש צורך, התאם את עוצמת הלייזר ואת ההגבר (gain) כך שהאזורים הבהירים ביותר בתמונות של הבקרה החיובית לא יגיעו לרוויה. לאחר מכן, בחלון רכישת השליטה בלוחית, בחר ב-acquire plate כדי להתחיל את סריקת הלוחית.
המכשיר ירכוש באופן אוטומטי תמונה אחת לכל באר עבור כל המיקרופלטה ויאסוף אותן למסד נתונים של שרת SQL. לאחר סיום הסריקה, העלה את התמונות ל-D definition's. פתח את ה-developer עם אפשרות ה-slinger מופעלת.
צרו מרחב עבודה חדש. לאחר מכן, בתפריט הקובץ, בחרו בייבוא מותאם אישית (customized import). בשלב הבא, נווטו לתיקייה המכילה את התמונות ופתחו קובץ לדוגמה.
בחר מסנן ייבוא המזהה את פורמט התמונה ומבנה הקובץ שנוצרו על ידי פלטפורמת ה-image express ultra של molecular devices. כעת, כדי לעבד את התמונות, פתח תמונת בקרה וטען את טכנולוגיית רשת הקוגניציה הרצויה, או את אלגוריתם ה-CNT, או את מערכת הכללים. האלגוריתם המותאם אישית המשמש כאן תוכנן לזהות באופן אוטומטי את העובר, החלמון והראש, ולכמת את הבהירות והשטח של מבני ראש המבטאים GFP; הפעל את מערכת הכללים עד לשלב זיהוי הראש והחלמון.
כדי להבטיח שיוך נכון של שק החלמון והראש, שנו את מערכת הכללים כדי להתאים את סף הגילוי של החלמון במקרים שבהם החלמון גדול מדי או קטן מדי. לאחר מכן, הפעילו את מערכת הכללים עד לשלב הגילוי של מבני ראש בהירים. כדי להבטיח שיוך נכון של אזורים המבטאים GFP בראש, שנו את מערכת הכללים כדי להתאים את סף הגילוי של מבני הראש ככפולות של עצימות מינימלית, עד שגילוי מבני הראש הבהירים תואם לתצפית הוויזואלית.
בשלב הבא, בצעו ידנית את כל מערכת הכללים על מספר תמונות שנבחרו באופן אקראי, אשר הופקו מעוברים שעברו טיפול בשלילי (vehicle) ומתוך תמונות של בקרה חיובית מעוברים שעברו טיפול ב-PCI. כדי להריץ את האלגוריתם על כל תמונות הפלטה, בחרו את הפלטות לניתוח ובחרו ב-Analyze, ולאחר מכן נווטו למערכת הכללים המותאמת (optimized rule set) ובצעו ניתוח לכל הבארים.
באמצעות מתזמן המשימות המובנה, בארות ריקות או תמונות מעורפלות יוחרגו אוטומטית מהניתוח במהלך הסריקה. מפה של הבארות שנשמרו (keep map) המוצגת בעדכון רציף תופיע על המסך. הן הנתונים והן התמונות נגישים במהלך ההרצה לצורך בדיקה ויזואלית.
הנתונים המספריים והתמונות המעובדות נשמרים באופן אוטומטי. לאחר ניתוח כל התמונות, ניתן לייצא את הנתונים לתוכנות צד שלישי כגון Excel, GraphPad או prism. איור זה מציג תמונות סריקה מארכיון של באר שעברה טיפול ברכב ובאר שעברה טיפול BCI, עם ובלי ניתוח CNT.
חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) שיושם מזוהה בעין, בגבול שבין המוח האמצעי לאחורי ובגנגליון התריגמין של עוברים טרנסגניים. שימו לב כי הן עצימות ה-GFP והן תחומי הביטוי מורחבים. בעוברים שטופלו ב-BCI המוצגים כאן, נראה השפעה תלוית-מינון של BCI על ביטוי הגן המדווח GFP בעוברים טרנסגניים.
הריכוז הדרוש להשגת תגובה מקסימלית של מחצית, או EC 50, היה בערך 12 micromolar. הרגע הדגמנו כיצד להרביע, לאסוף ולסדר עוברים של דגי זברה טרנסגניים בלוחות של 96 בארות. הוספנו ריכוזים עולים של PCI כפעיל של מסלול האיתות.
הראינו גם כיצד להפוך לאוטומטי את הדימות של עוברים טרנסגניים וניתחנו את התמונות באמצעות אלגוריתם שתוכנן במיוחד המבוסס על טכנולוגיית רשת קוגניציה. באמצעות גישה זו, יכולנו למדוד באופן כמותי ומדורג את ההשפעות של מולקולה קטנה המפעילה את השליח של fibroblast growth factor. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לבחור את העוברים בקפידה כדי לצמצם את השונות בין הדגימות.
זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.
סקירה כללית
מחקר זה מציג מערכת לדימות וניתוח אוטומטיים של עוברים טרנסגניים של דגי זברא (zebrafish) בלוחיות מולטי-וול (multiwell plates). הוא מדגים את היכולת למדוד השפעות תלויות-מינון של המולקולה הקטנה BCI על ביטוי גן ד reporter של גורם גידול פיברובלסטים (Fibroblast Growth Factor), ובכך מסייע לביצוע סריקות כימיות בעלות תפוקה גבוהה בדגי זברא.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי העצבים
- ביולוגיה התפתחותית
- סריקה בשפיעות גבוהה
רקע
- דגי זברה משמשים נפוצה כאורגניזם מודל בביולוגיה של ההתפתחות.
- דגי זברה טרנסגניים יכולים לבטא חלבונים פלואורסצנטיים, מה שמאפשר ויזואליזציה של ביטוי גנים.
- סריקה בעלת תוכן גבוה (High-content screening) מאפשרת ניתוח של מספר דגימות בו-זמנית.
- ש 이는 של גורם גדילה של פיברובלסטים (FGF) חיונית לתהליכי התפתחות שונים.
מטרת המחקר
- פיתוח מערכת דימוי בתפוקה גבוהה עבור עוברים של דגי זברה.
- הערכת ההשפעות של מולקולות קטנות על סיגנל FGF.
- אוטומציה של ניתוח ביטוי גנים בדגי זברה טרנסגניים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכשרה של דגי זברפיש טרנסגניים ואיסוף עוברים.
- דגירה של עוברים בפלטות רב-בארים עם ריכוזים משתנים של BCI.
- דימוג אוטומטי באמצעות קורא פלטות קונפוקאלי.
- ניתוח עצימויות פלואורסצנציה באמצעות אלגוריתם ייעודי.
תוצאות עיקריות
- דימוי וניתוח מוצלחים של עוברי דגי zebrafish בפורמט של סריקה רב-דגימתית (high-throughput).
- הדגמה של השפעות תלויות-מינון של BCI על סיגנל FGF.
- ניתוח אוטומטי סיפק כימות מהימן של ביטוי גנים.
- ביסוס פלטפורמה לסריקה כימית עתידית בדגי zebrafish.
מסקנות
- המערכת שפותחה משפרת את היעילות של סריקות כימיות בדגי זהב (zebrafish).
- היא מספקת כלי בעל ערך לחקר אותיות FGF במהלך ההתפתחות.
- ניתן להחיל מתודולוגיה זו על מולקולות קטנות ונתיבי סיגנל אחרים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
דימות ואנליזה אוטומטיים של עוברים של דג הזברה מאפשרים הערכה רחבה של מודולציה של מסלולי איתות in vivo, ובכך תומכים בתיקוף מוקדם של מטרות ובצמצום סיכונים מכניסטיים בתהליכי גילוי. גישה זו מספקת מדדים כמותיים התלויים במינון, המשפרים את הביטחון החזוי בהשפעות של תרכובות על פעילות מסלול ה-FGF/RAS/MAPK. דבר זה ממתג את השיטה כגשר תרגומי בין סריקה פנוטיפית לזיהוי מובילים (lead identification) במחקר ופיתוח בביו-פארמה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות על ידי מודולציה של שסורב FGF במערכת חולייתית רלוונטית למחלה.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות כימות אוטומטי של ביטוי רפורטר GFP במבני ראש עובריים.
- ערך ניבוי: מייצר נתוני EC50 (כ-12 micromolar עבור BCI) לצורך הנחיית קשרי מבנה-פעילות ומיון תיקי פיתוח.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מוכנות הבדיקה: מייצר תוצאות סטנדרטיות וניתנות לשחזור של עוצמה פלואורסצנטית מפורמטים של פלטות בעלות 96 בארות, התואמים לזרימות עבודה של סריקה רחבה (high-throughput).
- יכולת הרחבה: מאפשר סידור של עוברים טרנסגניים בגיל 24 hpf לטיפול בתרכובות ובדימות אוטומטית באמצעות קוראי HCS קונפוקליים.
- תועלת האלגוריתם: אלגוריתם Cognition Network Technology מותאם אישית מזהה ומכמת ביטוי של GFP באזורים עובריים מוגדרים, מה שמאפשר הערכה מהימנה של התרכובות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רציפות תרגומית: שימוש בעוברי דג זברה בגיל 24-48 hpf, שלב התפתחותי שבו האיברים כבר נוצרו והרקמות שקופות, מה שתומך בהסברה (extrapolation) ממודלים של in vivo לשלב הפרה-קליני.
- הפחתת סיכונים מכניסטיים: מדידת תגובות ספציפיות למסלול (אקטיבציה של FGF) כדי להבחין בין השפעות של תרכובות על המטרה (on-target) לבין השפעות חוץ-מטרה (off-target).
- הלימה של סמנים ביולוגיים: ביטוי של GFP reporter משמש כסמן ביולוגי תרגומי למודולציה של מסלול ה-FGF, הניתן לגילוי באמצעות ניתוח תמונות אוטומטי.
שילוב תהליכי עבודה וקווי עיבוד
השיטה משתלבת בתהליכי עבודה של שלבי הגילוי המוקדמים, תומכת בבדיקת השערות בתהליכי תיקוף מטרה (target validation) ומאפשרת פיתוח סקלאבילי של בדיקות (assays) עבור קמפיינים לזיהוי מובילים (lead identification).
- ביולוגיה של גילוי: מסייע להבהרת מסלולים ולביסוס הביטחון במטרה באמצעות ניתוח תגובה למניה של מודולציה של איתות FGF.
- סריקה: מספקת מוכנות לבדיקה באמצעות רכישת תמונות וניתוח אוטומטיים, המבטיחים הדירות בין ריכוזי תרכובות שונים.
- אנליטיקה: מספקת מדידות כמותיות של משתנים תלויים (עוצמת GFP ושטח) המאפשרות השוואה בין עוצמה ויעילות של תרכובות.
- מחקר תרגומי: מקשר לרציפות פרה-קלינית על ידי שימוש בעוברים של חולייתנים בעלי מסלולי איתות שמורים ואורגנוגנזה נראית לעין.
- שימוש חוזר ארגוני: מכונן פלטפורמה ניתנת לשימוש חוזר לסריקה של מולקולות קטנות ומסלולי איתות מרובים באמצעות רפורטרים טרנסגניים ניתנים להחלפה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי במודולציה של המטרה ומפחית עמימות מכניסטית בשלבי סריקה מוקדמים.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה והשחזוריות באמצעות דימות אוטומטי וניתוח מבוסס אלגוריתם.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות לגבי המשך או הפסקה של התהליך (go/no-go) על ידי אספקת נתונים כמותיים ותלויים במינון על פעילות המסלול.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעודוף של תרכובות מותאם סיכון בהתבסס על EC50 ומדדי תגובה מקסימלית.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בגידול דגי zebrafish, טיפול בעוברים טרנסגניים ובמיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
- תלוי במכשור לסריקה בעלת תוכן גבוה במיקרוסקופ קונפוקאלי (למשל, Molecular Devices ImageXpress Ultra) ובתוכנה לניתוח תמונות (Definiens Developer).
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית עבור שלבי התפתחות העובר, הכנת תרכיבים ופרמטרים של רכישת תמונות.
- כולל שיקולי התאמה בעת יישום האלגוריתם עבור רפורטרים טרנסגניים שונים או מבנים עובריים שונים.
- מגבלות מעשיות כוללות שונות בין העוברים ואת הצורך בבחירה קפדנית של הדגימות כדי למזער רעשים, כפי שצוין בפרוטוקול.
