Assaying β עמילואיד רעילות באמצעות טראנסגנטי ג elegans דגם
9 באוקטובר 2010
התולעת נמטודות למד באינטנסיביות Caenorhabditis elegans יכול להיות מהונדסים transgenically לבטא את הפפטיד האדם β עמילואיד (Aβ). ביטוי מושרה של Aβ ב ג elegans מוביל פנוטיפ, שיתוק לשחזור מהיר שיכול לשמש כדי לפקח על טיפולים לווסת רעילות Aβ.
המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לבחון את הרעילות של פפטיד בטא-עמילואיד במערכת מודל InVivo. השחזוריות והפשטות היחסית של בדיקה זו מאפשרות בדיקה מהירה של תרופות, תנאים סביבתיים או שינויים גנטיים על רעילות בטא-עמילואיד. גורם מרכזי בפיתוח בדיקה זו הוא יצירת תולעי cl egan's טרנסגניות עם ביטוי של פפטיד בטא-עמילואיד הניתן להשראה תרמית וספציפי לשרירים.
ביטוי תלוי טמפרטורה זה끔 הנדס על ידי בניית טרנסגן המכיל אזור לא מתורגם (UTR) של' 3 ארוך באופן חריג, ההופך את ה-mRNA של הטרנסגן למטרה של מערכת הפיקוח על mRNA. לפיכך, הביטוי של טרנסגן זה הוא דל בתולעים מסוג פרא בעלות מערכת פיקוח תקינה על mRNA, עקב פירוק ה-mRNA של הטרנסגן. אם טרנסגן זה מוחדר לרקע גנטי המכיל מוטציה ברכיב חיוני של מערכת הפיקוח על mRNA, ביטוי הטרנסגן יהיה גבוה משמעותית. אם הרקע הגנטי מכיל מוטציה תלוית טמפרטורה במערכת הפיקוח על mRNA, הרי שהנחלה של זן טרנסגני זה בטמפרטורה לא מאפשרת תחסום את פירוק ה-mRNA של הטרנסגן ותביא לביטוי גבוה של הטרנסגן. תולעים טרנסגניות המשתמשות במערכת זו כדי לווסת את הביטוי של פפטיד בטא-עמילואיד בשרירי דופן הגוף, יעניקו תגובה להעלאת הטמפרטורה מ-16 °C ל-25 °C בצורה של הצטברות גבוהה של פפטיד בטא-עמילואיד, תפקוד לקוי של תאי השריר ושיתוק של התולעים, תוך מדידה של הזמן.
נדרש אוכלוסייה של תולעים טרנסגניות אלו כדי להגיע לשיתוק לאחר העלאת טמפרטורה. העלאה זו מהווה בדיקה רגישה לרעילות של beta amyloid. הדבר מושג על ידי הכנת מצעי גידול טריים לנמטודות עבור בדיקת השיתוק, דבר המסייע בצמצום משתנים סביבתיים העלולים להשפיע על שיעורי השיתוק.
כשלב שני, מקימים אוכלוסיות מסונכרנות גילאים של תולעים טרנסגניות, דבר הממזער את השפעות שלב ההתפתחות על ביטוי הגן הטרנסגני. לאחר מכן, תולעים מסונכרנות בשלב הזחל השלישי מועברות מטמפרטורה של 16 °C ל-25 °C, מה שמגביר את יציבות ה-mRNA של הגן הטרנסגני ומוביל להצטברות של פפטיד בטא-עמילואיד. מדידת הזמן מרגע העלאת הטמפרטורה ועד להופעת שיתוק בכל תולעת מאפשרת לקבוע את קצב הליקוי התפקודי של השרירים, ובכך לבחון את ההשפעות הרעילות של הצטברות פפטיד בטא-עמילואיד; התוצאות המתקבלות מראות את השפעתם של טיפולים ספציפיים על הרעילות של פפטיד בטא-עמילואיד המבטא באופן אנדוגני.
היתרון המרכזי של הטכניקה שלנו, לעומת שימוש במודלים של עכברים טרנסגניים לבדיקת פעילות תרופתית, הוא היכולת לבצע אותה במהירות רבה יותר ובעלות נמוכה בהרבה. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית. דירוג של תולעי L4 בבדיקת שיתוק הוא קשה מאוד ללמידה.
לכן, כאשר אתם מעריכים תולעת בשלב L4 משותקת, עליכם לבחון את התנועה המבודדת של אזור הראש של התולעת. ברגע שחלק זה נע בעוד שכל שאר גוף התולעת משותק, נגדיר תולעת זו כמשותקת. ניסויי שיתוק מבוצעים על מצע גידול סטנדרטי לנמטודות (NGM), המשמש באופן שגרה לגידול וגנטיקה של *C. elegans*.
להכנת המצעים, עקרו באוטוקלב את תמיסת ה-NGM המכילה sodium chloride, agar ופפטיד בבליל ארלנמאייר, ולאחר מכן הוסיפו את הכמויות המתאימות של התמיסות הסטריליות הבאות המפורטות בפרוטוקול הכתוב המצורף. חלקו 10 milliliters של NGM נוזלי לכל צלחת פטרי בגודל 60 מילימטר על 15 מילימטר. הניחו ל-NGM להת굳ד במהלך הלילה בטמפרטורת החדר.
אם בודקים את השפעותיהם של תרכובות או תמציות, יש לחלק את התמצית למנות בכל צלחת ולהשתמש במפריד (spreader) כדי להפיץ אותה באופן שווה על פני שטח הצלחת. יש להניח לצלחות להתייבש למשך הלילה בטמפרטורת החדר. נפחים הגדלים מ-1 mL ידרשו זמן ייבוש ממושך יותר.
לאחר מכן, טפטפו על כל צלחת 250 µL של זן *E. coli* OP 50 שגודל במצע LB למשך לילה עד לצפיפות אופטית של 0.4 עד 0.6, והמתינו לייבוש החיידקים למשך לילה בטמפרטורת החדר. לגיל הצלחת השפעה משמעותית על שיעור השיתוק, ובהתאם לכך צלחות ישנות נוטות להתייבש. יש למזוג את הצלחות תוך שבוע לפני ביצוע בדיקת השיתוק.
באופן אידיאלי, מומלץ להשתמש בצלחות שנשפכו שלושה עד ארבעה ימים לפני הנחת הביצים הסינכרונית; כל הצלחות המשמשות בניסוי כלשהו צריכות להגיע מאותה סדרה. שינוי של גודל המצע (lawn) ו/או של חיידקי ה-bacteria ישנה גם הוא ישפיע על התנהגות התולעים. ניתן לבצע בדיקות שיתוק (Paralysis assays) באמצעות זני e coli חלופיים. לדוגמה, HT15 משמש בניסויי RNAi. עם זאת, דבר זה עשוי לשנות את הקינטיקה של בדיקת השיתוק.
לפיכך, יש להשתמש בביקורות פנימיות המתאימות לזן. זן CL 476 הוא הנפוץ ביותר לבדיקת שיתוק המושרה על ידי בטא. זן זה ומודלים טרנסגניים אחרים זמינים לחוקרים אקדמיים תמורת תשלום סמלי ממרכז הגנטיקה של Saint Ahadi.
כדי למקסם את סנכרון הגיל של אוכלוסיית הבדיקה, עדיף להתחיל עם דור הורים מסונכרן. שבוע לפני תחילת בדיקת השיתוק של אוכלוסיית הבדיקה, השתמשו במלקח תולעים מפלטינה כדי להעביר 20 עד 30 מבוגרים בשלב ה-grave למספר מצעי NGM של 10 סנטימטר.
הפריסו עם OP 50 להטלת ביצים במשך שעתיים בטמפרטורה של 16 degrees Celsius, שהיא הטמפרטורה המאפשרת עבור CL 4 1 76. הסירו את המבוגרים של GR ואפשרו לצאצאים לגדול במשך שבעה ימים, עד לרגע שבו יהיו מבוגרים של היום השני לגרביטציה. גרביטציה של היום השני.
משתמשים בבוגרים כדי להכין אוכלוסיות בדיקה סינכרוניות גיל עבור כל תנאי ניסויי. המטרה היא להפיק פלטות בשלוש חזרות המכילות 50 עד 75 תולעים סינכרוניות גיל באמצעות מחט פלטינה לבחירת תולעים. העבירו 10 עד 12 בוגרים בשיא פריונם (day two graver) אל פלטות NGM של 60 מילימטר המוכתמות ב-OP 50. אפשרו לתולעים להטיל ביצים בטמפרטורה של 16 degrees Celsius למשך שעתיים, לאחר מכן הסירו את הבוגרים ואפשרו לביצים לבקוע ולגדול בטמפרטורה של 16 degrees Celsius.
בשלב זה, מומלץ שמי שלא יבצע את דירוג הפלטות יקודד אותן, כדי שהדירוג יתבצע באופן עיוור לתנאי הניסוי. שלב ההתפתחות העוברית בעת הנחת הביצים, שהוא בערך שלב 26 התאים עבור תולעים מסוג פרא בתנאים אופטימליים, הוא פונקציה של גיל המבוגרים והתזונה שלהם. אם המבוגרים ששימשו להנחת הביצים הם מבוגרים יותר או רעבים, יונחו ביצים בשלבים מאוחרים יותר ולא תושג אוכלוסייה סינכרונית, דבר שישפיע על הקינטיקה של בדיקת השיתוק.
חיוני להשתמש בתרביות חיידקים מونو-גניות כגון e coli, OP 50, מכיוון שזיהום חיידקי מכל סוג עלול להשפיע קשות על בדיקה זו. השחזוריות היא הגבוהה ביותר כאשר בצלחות השלישייה יש מספר דומה של תולעים. כדי להשרות את הגן התחליפי ולבצע את בדיקת השיתוק, העלו את טמפרטורת הצלחות ל-25 degrees Celsius.
48 שעות לאחר סיום הנחת הביצים הסינכרונית, התולעים צריכות להיות בשלב הלרוות השלישי. יש לסדר את הפלטות ללא ערימה בתוך אינקובטור בטמפרטורה של 25 degree Celsius כדי לאפשר לפלטות להגיע לטמפרטורה זו. במקביל, יש להתחיל בדירוג השיתוק של התולעים 18 עד 20 שעות לאחר תחילת העלאת הטמפרטורה.
בשלב זה, כל התולעים באוכלוסייה אמורות היו להגיע לשלב הלרבה הרביעי; המשיכו בתיעוד התוצאות במרווחי זמן של שעתיים, עד שכל התולעים בכל אחת מהצלחות הפטרי יהיו משותקות. מסיבות לא ידועות, השתיקה אינה אחידה לאורך הגוף. אזור הראש הוא החלק האחרון של התולעת שחדל מלזוז.
לפיכך, תולעים שרק החלו לעاني משיתוק אינן יכולות לנוע לאורך הפיתה, אך הן יכולות להניע את ראשיהן, ובכך לנקות את החיידקים מסביב לקדמת גופן ולהותיר הילה של חיידקים שנוקו. תולעים אלו יהפכו בהכרח למשותקות לחלוטין, ולכן תולעים בעלות הילות מאופיינות כמשותקות. חלק מהתולעים לא יציגו הילות, אך גם לא יראו תנועה ספונטנית.
אלו נבדקים על ידי דקירה בעזרת דוקר התולעים. אם תולעת שנדקרה אינה מסוגלת לבצע התפשטות של גל גוף מלא בעקבות הדקירה, היא תיסמן גם היא כמשותקת לצורך דירוג יעיל. הדרך הקלה ביותר היא להעביר את התולעים המשותקות לסקטור בצלחת שאינו מסומן, כדי שלא ייסמנו שוב בטעות במועד הדירוג הבא.
דבר זה מאפשר גם לתולעים שסווגו באופן שגוי להפגין תנועה, מה שמאפשר תיקון של הניקוד כדי להפיק עקומת שיתוק. בכל נקודת זמן, החלק של התולעים בכל צלחת שלא שותקו מומר לאחוזים, ואחוז התולעים שאינן משותקות בממוצע נסרט מול הזמן מרגע תחילת ה-upshift. העקומה המתקבלת היא אנלוגית מבחינה פורמלית לעקומת הישרדות, ולכן ניתן לנתח אותה באמצעות סטטיסטיקה סטנדרטית לא-פרמטרית של הישרדות.
את העלאת המתח (upshift) של תולעי ה-beta-amyloid טרנסגניים המבטאים את החלבון תחת מקדם myo-3 יש לבצע עד אמצע שלב L4, כדי שיתחיל תהליך השיתוק. מקדם myo-3 מווסת התפתחותית. ברגע שהתולעים מגיעות לשלב L4 מאוחר או לבגרות, רמת הביטוי יורדת באופן משמעותי.
הביטוי של הגן הטרנסגני נחסם אם התולעים רעבות, לכן חיוני מאוד שהתולעים יוזנו היטב לאורך כל הניסוי. מעולם לא צפינו תולעת משותקת מחלימה תחת שום תנאי. לאחר 12 עד 16 שעות של Upshift, זן CL 41 76 יהיה משותק, ללא קשר לשאלה אם תבצעו downshift ל-16 degrees; בזן CL 41 76, עלייה בביטוי הגן הטרנסגני הגורמת לשיתוק עשויה להתרחש גם בטמפרטורות נמוכות יותר.
עם זאת, שימו לב כי עיתוי שיעור השיתוק יושפע. שיעור השיתוק תלוי בזן הטרנסגן הספציפי שבו נעשה שימוש. בנינו שלושה זני myo A beta ששיעור השיתוק שלהם מהיר יותר או איטי יותר מזה של CL 41 76, ולכן עליכם להתאים את חלון הדירוג עבור בדיקת השיתוק בהתאם.
מוצג כאן גרף של עקומת שיתוק עבור CL 4 1 76, הן ללא טיפול והן לאחר חשיפה ל-6.27 millimolar של קפאין. טיפול זה גורם לעיכוב מובהק סטטיסטית בשיתוק של כארבע שעות, דבר שאנו מפרשים כאינדיקציה לדיכוי של רעילות בטא. במודל זה, ניסוי זה בחן את ההשפעות של תרכובת נוספת הנמצאת בקפה.
הגרף אופייני לטיפולים שאינם משפיעים על רעילות בטא. שימו לב שבשני הניסויים, כמחצית מאוכלוסיות ה-CL 4 1 76 שלא טופלו היו משותקות לאחר 24 שעות, והשיתוק היה מלא עד לשעה ה-28. אלו הם לוחות זמנים טיפוסיים לשיתוק של קבוצת הביקורת.
באוכלוסיות של CL 4 1 7 6, סטיות משמעותיות מעיתוי זה מעידות על תנאי סביבה שונים או על מחיקה ספונטנית של עותקים של הגן המועבר. עיינו בפרוטוקול המצורף לקבלת מידע נוסף על זן CL 4 1 76. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור את גיל המצעים, את שלב התפתחות אוכלוסיית התולעים ואת היכולת להעריך את שיעור השיתוק של התולעים.
לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה כיצד להשתמש במערכת של תולעי הים הללו כדי לבחון במדויק את הרעילות של בטא-עמילואיד. אתם תהיו מסוגלים לזהות השפעות עדינות למדי של טיפולים תרופתיים או סביבתיים שונים על רעילות זו. המשתנים שדנו בהם חשובים לתשומת לבכם, שכן הם יאפשרו לכם לבצע את הבדיקה באופן הדיר באופן רב ועם קינטיקת שיתוק עקבית.
זהו למעשה נושא חשוב למדי אם ברצונכם להשוות את התוצאות שהושגו במעבדה שלכם בזמנים שונים על ידי אנשים שונים, או להשוות את תוצאותיכם לאלו של חוקרים אחרים המשתמשים במודל מערכת זה.
סקירה כללית
מאמר זה מפרט בדיקה רהוטה במערכת in vivo המשתמשת ב-Caenorhabditis elegans טרנסגני למדידת הרעילות של פפטיד בטא-עמילואיד (Aβ) אנושי, גורם מרכזי במחלת אלצהיימר ובמיאוזיטיס עם גופי תסנין (Inclusion Body Myositis). הפרוטוקול מנצל ביטוי של Aβ הספציפי לשריר ומוגש על ידי טמפרטורה כדי להשראת פנוטיפ של שיתוק הניתן לשחזור, מה שמאפשר סריקה מהירה וחסכונית של משנים גנטיים, סביבתיים או פסיקולוגיים של רעילות Aβ.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- ניורודגנרציה
- מחקר באורגניזמי מודל
- טוקסיקולוגיה
- סריקת תרופות
רקע
- הצטברות של β-amyloid מעורבת במחלת אלצהיימר וב-Inclusion Body Myositis.
- תולעי C. elegans טרנסגניים המבטאים Aβ אנושי מראים פנוטיפים מדידים, כגון שיתוק, המשקפים את הרעילות של Aβ.
- מוטציות רגישות לטמפרטורה במערכת הפיקוח על mRNA מאפשרות ביטוי הקיים (inducible) של Aβ ברקמת שריר.
- מודל זה מאפשר הערכה מהירה וניתנת לשחזור של התערבויות שעשויות לווסת את הרעילות של Aβ.
מטרת המחקר
- מתן פרוטוקול מפורט למדידת קצב השיתוק ב-C. elegans טרנסגני המבטא Aβ בשריר.
- הדגשת משתנים ניסיוניים קריטיים המשפיעים על הדיוק והרגישות של הבדיקה.
- הדגמת התועלת של הבדיקה לבחינת תרופות, שינויים גנטיים או גורמים סביבתיים המשפיעים על רעילות של Aβ.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- יצירת C. elegans טרנסגני עם ביטוי Aβ תלוי-טמפרטורה וספציפי לשריר באמצעות מערכת שונה של בקרה על mRNA.
- הכנת מצעי גידול לנמטודות (NGM) טריים ואוכלוסיות תולעים מסונכרנות גיל.
- העלאת טמפרטורה מ-16°C ל-25°C כדי להשרות ביטוי של Aβ ושיתוק עוקב.
- דירוג השיתוק על בסיס אובדן תנועת הגוף, עם קריטריונים ספציפיים לתנועת הראש ותגובה לדחיפה.
- שרטוט וניתוח סטטיסטי של עקומות שיתוק באופן אנלוגי לניתוח הישרדות.
תוצאות עיקריות
- העלאת טמפרטורה מובילה להצטברות מהירה של Aβ בשריר, הגורמת לשיתוק פרוגרסיבי בתולעים טרנסגניות.
- הבדיקה רגישה למשתנים ניסיוניים כגון גיל הפלטה, שלב ההתפתחות של התולעת וזן החיידק.
- טיפולים (למשל, קפאין) יכולים לעכב משמעותית את השיתוק, דבר המעיד על דיכוי של רעילות Aβ.
- ניתן להשיג קינטיקה עקבית של שיתוק באמצעות בקרה קפדנית של תנאי הניסוי, דבר המאפשר תוצאות הניתנות לשחזור בין ניסויים ומעבדות שונות.
מסקנות
- מודל C. elegans זה מספק בדיקה מהירה, יעילה מבחינה כלכלית ורגישה לרעילות של Aβ in vivo.
- הפרוטוקול מאפשר זיהוי של השפעות ויסות עדינות הנובעות מתרופות, שינויים גנטיים או גורמים סביבתיים.
- תשומת לב למשתנים מרכזיים מבטיחה הדירות והשוואתיות של התוצאות בתוך קבוצות מחקר וביניהן.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מודלים טרנסגניים של C. elegans עם ביטוי אינדוקבילי של β-amyloid ספציפי לשריר מספקים מערכת in vivo מהירה וניתנת לשחזור לבחינת מנגנוני רעילות של עמילואיד הרלוונטיים למחלות ניוורו-דגנרטיביות. בדיקה זו מאפשרת הערכה כמותית בספיקה גבוהה של משנים גנטיים, סביבתיים או פרמקולוגיים, ובכך תומכת בתיקוף של מטרות בשלבים מוקדמים ובצמצום סיכונים מנגנוניים. גישה זו מסייעת בביסוס ביטחון חיזוי בבדיקת היפותזות טיפוליות ובמיון פורטפוליו עבור מסלולי פיתוח לניוורו-דגנרציה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשרת בחינה פונקציונלית של מסלולי רעילות עמילואיד באורגניזם חי.
- תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות כימות של תוצאים פנוטיפיים של התערבויות גנטיות או תרופתיות.
- מסייע לביטחון חיזוי במעורבות המטרה (target engagement) ובהשפעות במורד המסלול (downstream effects).
- מספקת פלטפורמה למיון מהיר של מטרות פוטנציאליות או משני פעילות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק מערכת מתוקפת וניתנת להרחבה לסריקת תרכובות או מוטציות גנטיות המווסתות רעילות של עמילואיד.
- מבצע סטנדרטיזציה של מדידות כמותיות (קינטיקה של שיתוק) לצורך השוואות הדירות וניתנות לשחזור בין מחקרים.
- מאפשר מוכנות של הבדיקה להערכה בסריקה רחבה (high-throughput) של התערבויות מגוונות.
- תומך בהערכה מהימנה של תרכובות באמצעות אוכלוסיות מבוקרות ומסונכרנות גיל.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- תואם למנגנונים רלוונטיים למחלה המעורבים באלצהיימר ובמיופתיות.
- מספק רצף תרגומי משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני של משני רעילות.
- מאפשר קבלת החלטות על קידום מותאם סיכונים בהתבסס על מודולציה פנוטיפית in vivo.
- מציע הפחתת סיכונים חזויה עבור תרכובות לפני השקעה במודלים של יונקים.
שילוב תהליכי עבודה (Pipeline & Workflow)
בדיקה זו ממוקמת ברצף שבין הגילוי המוקדם לזיהוי מוביל, ובקוכה היא מגשרת בין בדיקת השערות מכניסטיות לבין בחירת מועמדים פרה-קליניים.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות ובהבהרת מסלולים עבור רעילות עמילואיד.
- סריקה: מספק קריאות כמותיות וניתנות לשחזור של שיתוק עבור סריקות גנטיות או סריקות של תרכובות.
- אנליטיקה: מייצר עקומות דומות לעקומות הישרדות ופלטים סטטיסטיים להשוואה רחבה של תנאים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין פנוטיפים in vivo לנקודות סיום רלוונטיות למחלה לצורך רצף פרה-קליני.
- שימוש חוזר ארגוני: משמש כפלטפורמה לשימוש חוזר להערכת משנים מגוונים על פני תוכניות שונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקר של ניוון עצבי.
- ערך תפעולי: מספק בדיקות in vivo סטנדרטיות, ניתנות להרחבה וניתנות לשחזור.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות go/no-go ויעילות הון על ידי מתן אפשרות להפחתת סיכונים בשלב מוקדם.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים וקידום של התערבויות מועמדות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בגנטיקה של C. elegans ובדירוג פנוטיפי.
- דורש תנאים סביבתיים מבוקרים והכנה סטנדרטית של מצעים.
- דורש סנכרון גיל קפדני ובקרות פנימיות להבטחת שחזור.
- התאמה בין זנים או התערבויות עשויה להשפיע על קינטיקת הבדיקה ועל חלונות הדירוג.
- יש לנהל את רגישות הבדיקה לגיל הפלטה, למסוג השבב החיידקי ולמשתנים סביבתיים.
